血清miR-27a評估胰腺癌患者化療療效和預后的臨床應用價值

朱善軍 徐震 沈昊 沈國榮 付海龍 楊鴻林 錢東林 沈振芳 石磊 錢紅英 朱安渡 馬春芳

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為21～24個核苷酸的非編碼小分子RNA，可在轉錄后水平調控靶基因表達。據報道，一些miRNA廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡和基因調控，在腫瘤的發生、發展中扮演重要角色[1]。miR-27a作為一種腫瘤相關基因，受到人們越來越多的關注，其異常表達與人類肺癌、食管癌、肝癌、胃癌等惡性腫瘤存在相關性[2-5]，但通過監測miR-27a水平評估胰腺癌患者化療療效及預后的研究鮮見報道。本研究檢測胰腺癌患者化療前后血清miR-27a水平的變化，探討其臨床應用價值。

一、資料與方法

1．研究對象：收集2013年5月至2015年8月間南京醫科大學第一附屬醫院和南通大學附屬蘇州市吳江區第一人民醫院腫瘤科收治的169例胰腺癌患者，其中男性98例，女性71例，年齡 31～77歲，平均(58±8)歲。胰腺癌的診斷均經組織病理學檢查確診。患者隨訪至2015年10月。

2．化療方案及療效評價：患者接受美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)推薦的一線或二線藥物化療，一線藥物化療方案為吉西他濱，二線化療藥物為FOLFOX4方案。每個化療周期結束后參考RECIST標準進行療效評價。完全緩解(CR)：所有目標病灶消失和腫瘤標志物水平正常；部分緩解(PR)：基線病灶長徑總和縮小≥30%；病情進展(PD)：基線病灶長徑總和增加≥20%、絕對值增大5 mm或出現新病灶；病情穩定(SD)：基線病灶長徑總和有縮小但未達PR或有增加但未達PD，一個或多個非目標病灶和(或)腫瘤標志物高于正常持續存在。本組患者以一線藥物化療后的最好療效進行分組。

3．血清miR-27a檢測：采用雙重熒光定量PCR法檢測患者血清miR-27a水平。于化療前1～7 d及化療后1～2 d采集靜脈血2 ml，3 000 r/min離心5 min，取上層血清再于4℃ 16 000 g 離心10 min，分裝上層血清，置-70℃保存。2 h內應用Qiazol試劑提取血清總RNA，分光光度法測定其濃度和純度。采用RT試劑盒逆轉錄miR-27a和內參cel-miR-39，反應條件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。再在ABI 7 500熒光定量PCR擴增儀擴增，反應條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 1 min，45個循環。數據采集和處理由軟件SDS system software完成[8]。miRNeasy Mini Kit購自美國Qiagen公司，Taqman miRNA逆轉錄試劑盒、miRNA特異性莖環結構逆轉錄引物、雙重熒光定量PCR引物和探針均購自美國Appliued BioSystems公司，Real-time PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。

4．統計學處理：應用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。采用 Shapiro-Wilk 正態性檢驗考察計量資料的分布，偏態資料以M(P25,P75)表示，組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，化療前后比較采用Wilcoxon配對秩和檢驗。生存曲線分析采用Kaplan-Meier方法，并進行Log-rank檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

二、結果

1．胰腺癌患者化療療效：169例患者接受一線或二線藥物化療后獲得有效隨訪146例，有效隨訪率為86.4%。依據RECIST標準，無CR病例，PR 91例，SD 39例，PD 16例。

2．胰腺癌患者化療前后血清miR-27a水平變化：146例胰腺癌患者化療前血清miR-27a水平為1.75(1.09～2.22)，化療后為2.88(0.91～4.43)，化療后較化療前顯著升高，差異有統計學意義(Z=-4.609，P< 0.001)。

3．胰腺癌患者化療前后血清miR-27a水平變化與化療療效的關系：化療前91例PR組和55例SD+PD組患者血清miR-27a水平分別為1.75(1.27～2.36)和1.83(0.95～2.19)，差異無統計學意義(Z=-1.018，P=0.309)。化療后PR組和SD+PD組患者血清miR-27a水平分別為3.90(2.96～5.21)和0.78(0.63～1.03)，化療后PR組顯著高于化療前，而SD+PD組水平顯著低于化療前，差異均有統計學意義(Z=-6.325，P<0.001；Z=-4.505，P<0.001)。此外，化療后PR組血清miR-27a水平顯著高于SD+PD組，差異也有統計學意義(Z=-7.821，P<0.001)。

4．血清miR-27a水平變化與患者生存時間的關系：至隨訪結束，146例患者存活時間為3～29個月，中位生存期為10.2個月，其中6個月、1年生存率分別為75.4%、52.8%。根據化療后血清miR-27a水平升高或下降將146例患者分為化療后升高組和下降組。81例升高組患者的平均生存時間為12.4個月，65例下降組患者的平均生存時間為8.6個月，升高組總體生存時間顯著長于下降組，差異有統計學意義(Z=8.241，P=0.001，圖1)。

討論胰腺癌是一種較常見的惡性腫瘤，惡性度高、療效欠佳、預后差，5年生存率小于5%。目前根治性切除是胰腺癌患者的首選治療方式，但由于早期診斷率低，僅有不到20%的患者存在根治性切除的手術機會。許多研究結果顯示，胰腺癌輔助化療對提高患者生活質量，改善患者預后均具有重要意義[6]。但由于個體差異加之缺乏準確的化療療效評價體系，傳統經驗化療所取得的效果并不令人滿意。為提高化療療效，改善患者預后，針對胰腺癌患者實施系統性、綜合性、個體化的規范診治已成為臨床化療的方向和趨勢[7]。

圖1 化療后血清miR-27a水平升高及降低組患者的Kaplan-Meier生存曲線

本研究結果顯示，146例胰腺癌患者血清miR-27a水平在化療后總體顯著升高，其中PR組患者血清miR-27a水平在化療后顯著升高，而SD+PD組患者化療后顯著下降，且化療后PR組顯著高于SD+PDF組，而化療前PR組和SD+PD組患者血清miR-27a水平差異無統計學意義，提示血清miR-27a水平有可能成為評估胰腺癌化療療效的血清學標志物。血清miR-27a水平升高可能與化療藥物誘導胰腺癌細胞發生凋亡，釋放大量miR-27a進入血循環所致。

根據Kaplan-Meier生存分析結果，化療后血清miR-27a水平升高的81例患者的平均生存時間顯著長于血清miR-27a水平下降的62例患者，與Wang等[8]報道的血清miR-638水平對非小細胞型肺癌患者具有重要的臨床應用價值結

果一致，提示血清miR-27a也可能成為評估胰腺癌患者預后的潛在的血清學標志物。

參 考 文 獻

[1] Esquela-Kerscher A, Slack FJ. Oncomirs-microRNAs with a role in cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2006, 6(4):259-269. DOI: 10.1038/nrc1840.

[2] Feng B, Wang R, Chen LB. MiR-100 resensitizes docetaxel-resistant human lung adenocarcinoma cells (SPC-A1) to docetaxel by targeting Plk1[J]. Cancer Lett, 2012, 317(2):184-191. DOI: 10.1016/j.canlet.2011.11.024.

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[7] 趙玉沛. 胰腺癌診斷與治療的現狀與未來[J]. 中華肝膽外科雜志, 2009,15(5):321-323. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1007-8118.2009.05.001.

[8] Wang F, Lou J-f, Cao Y, et al. miR-638 is a new biomarker for outcome prediction of non-small cell lung cancer patients receiving chemotherapy[J]. Exp Mol Med, 2015, 47(5):e162. DOI: 10.1038/emm.2015.17.