大黃素聯合5AzA-cdR對胰腺癌裸鼠皮下移植瘤抑癌基因p16、RASSF1A、ppENK的去甲基化作用

周鴻鯤 梅小平 潘杰 褚永權 姚明 陳亮

胰腺癌發生是多基因遺傳和表觀遺傳共同作用的結果，基因異常甲基化是胰腺癌發病的重要原因之一，抑癌基因的高度甲基化可引起轉錄抑制甚至喪失，癌基因低甲基化可使其異常活躍，表達失控，從而導致細胞異常分化和增殖，發生癌變[1-2]。DNA甲基化指在DNA甲基轉移酶(DNMTs)催化下將甲基加到CG二核苷酸的胞嘧啶上,使之變成5甲基胞嘧啶(5-mc)的化學修飾過程[3]，DNMTs在腫瘤中表達增強，導致抑癌基因(TSG)高甲基化并失活，最終促進腫瘤發生。目前最常用于去甲基化的藥物有5AzA-cdR和地西他濱兩種核苷類似物，主要通過抑制DNMT的活性而發揮去甲基化作用[4]。但研究表明這兩種藥物的去甲基化作用特異性低且藥物安全窗小，易導致全部基因組的低甲基化。此外，核苷類似物不良反應大，限制了其在臨床上治療腫瘤的應用。本課題組前期研究證實大黃素、5AzA-cdR可以通過抑制DNMTs的表達對體外胰腺癌細胞PANC1的抑癌基因p16、RASSF1A、ppENK發揮一定程度的去甲基化作用[5-7]，當兩者聯合用藥時去甲基化作用更為明顯，故本研究通過建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，在體內水平進一步驗證大黃素聯合5AzA-cdR對p16、RASSF1A、ppENK去甲基化的作用。

材料與方法

一、材料和試劑

大黃素(純度≥98%)、5AzA-cdR購于Sigma公司，分別用DMSO配成10、20 mmol/L溶液儲存于-70℃，實驗前用培養液稀釋成工作濃度。細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心株型)購于上海捷瑞生物工程有限公司，EpiTect?MSP Kit試劑盒購于Qiagen公司。RNA提取試劑盒、RNA逆轉錄試劑盒購于Ferments公司，甲基化引物以及PCR引物由上海捷瑞生物技術有限公司合成，Anti-RASSF1a抗體、ppENK抗體購于Abcam公司，p16/INK4a抗體購于Epitomics公司。

二、細胞培養和胰腺癌裸鼠移植瘤模型的建立

人胰腺癌細胞株PANC1由本研究組引進并保存，常規培養傳代。4～6周齡的雌性裸鼠BALB/CA-nu(nu/nu)購于上海腫瘤研究所，體重18～20 g，飼養于嘉興學院醫學院實驗動物中心無特定病原體(SPF)環境中，并保持室溫在25℃、相對空氣濕度在40%～60%之間。適應性喂養1周后，取對數生長期PANC1細胞，用無血清培養液稀釋，于裸鼠右下腹部皮下注入含5×106個細胞的200 μl細胞懸液，喂養4～5周，待皮下移植瘤體積達到100～150 mm3時隨機分為4組，給予不同治療方案。對照組腹腔注射生理鹽水，大黃素組給予大黃素50 mg/kg灌胃，5AzA-cdR組腹腔注射5AzA-cdR 0.1 mg/kg，聯合用藥組給予大黃素50 mg/kg灌胃聯合腹腔注射5AzA-cdR 0.1 mg/kg，每組10只，每3 d治療1次，持續30 d。用藥期間每6 d用游標卡尺測量腫瘤的長度(L)和寬度(W)，按體積(V)=L×W2/2計算腫瘤體積。最后一次治療后1周處死裸鼠，取移植瘤組織，部分液氮保存，部分用4%甲醛溶液固定。

三、甲基化特異性PCR法(methylmion specific PCR,MSP)檢測抑癌基因甲基化水平

按照細胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書的方法分別提取上述4組移植瘤組織的DNA，分光光度法檢測DNA純度及濃度后，取1 μg DNA按照EpiTect?Bisulfite Kit修飾試劑盒說明書進行亞硫酸鹽修飾。參見本課題組既往發表的方法[5-7]，修飾后的DNA立即行RASSF1A、p16、ppENK的MSP反應，實驗重復3次。部分修飾后的DNA保存于-20℃冰箱。

四、熒光定量PCR法檢測抑癌基因mRNA表達

應用Trizol試劑提取上述4組移植瘤組織的總RNA，按試劑盒說明書先逆轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板行熒光定量PCR擴增。各個基因引物序列、反應體系以及條件參見本課題組既往發表的文章[5-7]，以GAPDH為內參，用p16、RASSF1A、ppENK的灰度值與GAPDH的灰度值比統計分析，實驗重復3次。

五、蛋白質印跡法檢測抑癌基因的蛋白表達

應用RIPA裂解液提取上述4組移植瘤組織總蛋白，使用BCA試劑盒定量蛋白后常規行蛋白質印跡法檢測p16、RASSF1A、ppENK蛋白表達，以GAPDH為內參。抗p16、RASSF1A抗體工作濃度1∶500稀釋，抗ppENK抗體工作濃度1∶1 000稀釋。最后ECL發光，X片曝光、顯影、定影。采用Image J軟件進行條帶掃描，以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示蛋白相對表達量。

六、統計學處理

結 果

一、大黃素聯合5AzA-cdR治療的抑瘤作用

對照組、大黃素組、5AzA-cdR組、聯合用藥組移植瘤重量分別為(0.28±0.01)、(0.17±0.01)、(0.12±0.02)、(0.08±0.01)g；體積分別為(517±0.02)、(382±0.01)、(232±0.03)、(169±0.01)mm3(圖1)，3個治療組移植瘤的重量及體積均顯著小于對照組，聯合用藥組又顯著小于2個單獨用藥組，差異均有統計學意義(P值<0.05或<0.01)。

圖1 聯合用藥組(1)、5AzA-cdR組(2)、大黃素組(3)、對照組(4)裸鼠移植瘤的的生長狀況

二、大黃素聯合5AzA-cdR治療對p16、RASSF1A、ppENK甲基化的影響

對照組、大黃素組、5AzA-cdR組、聯合用藥組移植瘤組織p16、RASSF1A、ppENK甲基化狀態見表1及圖2。對照組3個基因均呈高甲基化狀態，大黃素組p16、RASSF1A、ppENK甲基化程度輕微降低， 5AzA-cdR組去甲基化程度顯著強于大黃素組，聯合用藥組的去甲基化程度又顯著強于單獨用藥組，差異均有統計學意義。

注：M：甲基化；U：非甲基化圖2 對照組(1)、大黃素組(2)、5AzA-cdR組(3)、聯合用藥組(4)大鼠移植瘤p16、RASSF1A、ppENK甲基化狀態

三、大黃素聯合5AzA-cdR治療對p16、RASSF1A、ppENK mRNA及蛋白表達的影響

3個治療組裸鼠移植瘤組織p16、RASSF1A、ppENK mRNA及蛋白表達量均顯著高于對照組，聯合用藥組的表達量又顯著高于單獨用藥組，差異均有統計學意義(P值<0.05或0.01，表2，圖3)。

圖3 對照組(1)、大黃素組(2)、5AzA-cdR組(3)、聯合用藥組(4)大鼠移植瘤p16、RASSF1A、ppENK蛋白表達

討 論

大黃素治療胰腺癌的作用包括它可以誘導胰腺癌細胞發生凋亡，抑制新生血管形成以及聯合吉西他濱用藥可改善胰腺癌細胞對吉西他濱的耐藥性等方面，但其具體的機制并不是很明確。本課題組既

表1 四組大鼠移植瘤組織p16、RASSF1A、ppENK甲基化狀態

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01

表2 四組大鼠移植瘤組織p16、RASSF1A、ppENK mRNA及蛋白的表達

注：與對照組比較,aP<0.05，bP<0.01

往的研究結果顯示，大黃素可以通過去甲基化作用使胰腺癌細胞PANC1的抑癌基因p16、RASSF1A、ppENK甲基化水平下降而重新發揮抗癌活性，尤其當大黃素和5AzA-cdR聯合作用時其作用最強，表明大黃素抗胰腺癌細胞生長不僅可以通過凋亡途徑，亦可以通過對抑癌基因的去甲基化作用途徑。

目前關于胰腺癌的抑癌基因甲基化研究方興未艾，已報道的關于胰腺癌抑癌基因有CDKN1C、SPA、RC、TFPI-2、BNIP3、TSLC1、HHIP、MUC2、CXCR4、p16、RASSF1A、ppENK等，它們在胰腺癌組織中都有不同程度的甲基化，與其伴隨的是相應的mRNA表達不同程度的缺失，其中研究最多的抑癌基因甲基化主要有p16、RASSF1A、ppENK。Ueki等[8]和Fukushima等[9]報道，超過90%的胰腺癌組織ppENK基因發生甲基化。Schutte等[10]報道，95%的胰腺癌p16基因失活，其中15%和甲基化有關。Moore等[11]報道，27%的胰腺癌細胞系p16基因發生甲基化。Dammann等[12]報道，64%原發性胰腺導管細胞癌、83%的胰腺內分泌腫瘤以及88%的胰腺癌細胞系RASSF1A基因發生甲基化,應用去甲基化藥物5AzA-cdR處理胰腺癌細胞后，因去甲基化作用而失表達的ppENK、p16、RASSF1A得到不同程度的重新表達。

本研究的體內實驗結果顯示，大黃素、5AzA-cdR以及兩者聯合用藥可以抑制裸鼠移植瘤的生長，兩者聯合用藥的抑制作用最強；移植瘤組織p16、RASSF1A、ppENK 3個抑癌基因啟動子區高度甲基化狀態得到不同程度的逆轉，5AzA-cdR去甲基化作用較大黃素強，聯合用藥的作用更強，同時p16、RASSF1A、ppENK mRNA和蛋白的表達均增加，5AzA-cdR的作用強于大黃素，聯合用藥的作用又強于單獨用藥，此發現為大黃素治療胰腺癌的機制研究提供了一個新的思路。

參 考 文 獻

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