miR146a及miR155表達與益賽普治療類風濕關節炎療效及安全性的相關性研究*

佘若男，李 博，胡秋俠，吳系美，譚錦輝，胡建云，唐群芳，汪小平

（廣東省深圳市龍華區人民醫院風濕免疫科，廣東 深圳 518109）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種可致殘的自身免疫性疾病，以累及關節的滑膜炎為病理特征，是臨床常見的風濕病。由于病因及發病機制尚未完全闡明，其治療尚缺乏特異性手段。重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白（rhTNFR：Fc）是治療RA的強力武器，國內較早生產的rhTNFR：Fc的商品名為益賽普，經國家食品藥品監督管理總局批準用于RA的治療。越來越多的證據顯示，益賽普聯合甲氨蝶呤（MTX）治療RA可使RA的多種臨床表現和實驗室病情活動指標迅速得到改善，且治療安全性較高[1-3]。在使用益賽普聯合MTX治療RA的過程中存在一個重要問題，即約30%的RA患者使用了足夠療程的益賽普治療后病情無明顯改善。本研究中針對這部分患者，觀察了益賽普治療中國RA患者的療效，并探討其外周血單個核細胞（PBMC）中miR146a及miR155的表達與益賽普治療RA的療效相關性。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入標準[4]：符合1987年美國風濕病學學會（ACR）修訂的RA分類標準；病情處于活動期（關節腫脹數或壓痛數不少于3個；符合以下條件中的任意2個，隨訪當天的晨僵持續時間不少于45 min，C反應蛋白（CRP）不低于正常上限的1.5倍，血沉不低于28 mm/1 h；無結核、肝炎、腫瘤、多發性硬化、充血性心力衰竭、中樞性神經脫髓鞘病變和淋巴瘤等疾病；如果同時口服糖皮質激素，其劑量（相當于口服潑尼松的劑量）必須穩定在不超過10 mg/d，且至少持續4周；如果正在同時服用非甾體類抗炎鎮痛藥，則要求其劑量已穩定至少達2周；RA的關節外表現是指關節炎以外的其他所有臨床表現，包括眼部病變、肺部病變、皮膚病變、類風濕結節、血液系統病變等[5]；簽署知情同意書。

排除標準[4]：孕婦或哺乳期；嚴重的心、肺、腎、肝等臟器疾病或合并有血液、內分泌等其他系統病變及病史；4周內曾接受過關節腔內注射皮質類固醇治療；急性或慢性感染性疾病，包括活動性結核；合并有惡性腫瘤或有惡性腫瘤家族史。

病例選擇：選擇我院門診或住院風濕免疫科2013年6月至2016年3月收治的RA患者117例。其中，男18例，女 99例；年齡 21～74歲，平均（45±17）歲。

1.2 方法

所有患者均接受益賽普（三生國健藥業＜上海＞股份有限公司，國藥準字S20050058，規格為每支12.5 mg）聯合MTX治療，連續治療3個月。益賽普的給藥方法為每周1次，每次50 mg，皮下注射。

1.3 觀察指標與療效判定標準

療效及安全性評估：記錄入選的RA患者在治療前及之后每個月的臨床及實驗室檢查指標。主要包括全血細胞計數、尿常規、腎功能、紅細胞沉降率（ESR）、CRP、類風濕因子（RF）、抗環瓜氨酸肽抗體（抗CCP抗體）及抗核抗體（ANA）等。血清中RF的測定采用免疫比濁法，抗CCP抗體的測定采用酶聯免疫吸附法，ANA的測定采用間接免疫熒光法。

RA療效評估，采用歐洲抗風濕病聯盟（EULAR）與美國風濕病學會（ACR）共同修訂的臨床緩解新標準[4]，全部滿足以下條件即為達到RA臨床緩解新的標準：疼痛關節數量不超過1個，腫脹關節數量不超過1個，患者整體評估得分不超過1，ESR低于15 mm/1 h（女）、20 mm/1 h（男）或 CRP 水平不超過 1 mg/dL[4]。收集并記錄在治療過程中發生的所有不良反應，并分析不良反應與益賽普的相關性，必要時采取相應措施。

miR146a及miR155的表達水平檢測：治療前，采集外周血液15 mL，枸櫞酸鈉抗凝后用淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離PBMC，用1倍體積的PBS洗滌2次后定容至1 mL，吹打混勻后用細胞計數板計數。將以上PBMC轉移至1.5 mL無 RNA酶的EP管中，按Trizol法說明書提取總RNA，用核酸紫外分析儀檢測RNA濃度，保證光密度（OD260/280）位于 1.8～2.0，將 RNA 凍存于-80℃冰箱中備用。采用TaqMan?microRNA逆轉錄試劑盒（ABI公司），反應體系為 15 μL，按說明說操作。反應參數設置為：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃5 min，然后4℃延伸。選用RUN6為內參照。采用ABI公司的TaqMan?PCR試劑盒，反應體系為20 μL，按說明書操作。反應參數設置為：95℃ 10min，然后95℃ 15s，60℃ 60 s，進行40個循環。

1.4 統計學處理

采用SPSS 18.0統計軟件包進行分析。計量資料用±s表示，組間比較采取獨立 t檢驗；計數資料用率表示，采用 χ2檢驗。所有統計檢驗都進行雙側檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

治療后，臨床緩解91例，其余26例未達到臨床緩解標準。結果見表1和表2。

表1 RA患者的一般情況比較

表2 miR146a和miR155在各組RA患者PBMC的表達水平（±s）

表2 miR146a和miR155在各組RA患者PBMC的表達水平（±s）

項目miR146a miR155 RA患者（n=117）1.37 ± 0.62 1.86 ± 0.44緩解組（n=91）1.30 ± 0.62 1.87 ± 0.46未緩解組（n=26）1.59 ± 0.56 1.83 ± 0.33 t值-2.114 0.499 P值0.037 0.619

3 討論

microRNA通過與靶mRNA結合引起靶mRNA降解或翻譯受抑制，在轉錄后對靶基因的表達進行調控。一系列的研究證實，microRNA與多種疾病的發生相關，如癌癥、糖尿病、心臟病、感染及某些風濕病等，并有可能成為這些疾病的診斷、病情活動性及療效判斷的標志物，甚至成為潛在的治療靶點。microRNA為全面了解生命科學現象開了一扇新窗口，為疾病發生的機制與設計新的治療策略研究提供了新視角。microRNA的研究成為了分子醫學及分子生物學研究的熱點領域。研究發現，與健康人相比，RA患者體內miR146a的表達存在明顯異常，且還與RA患者體內一些炎癥相關細胞因子的產生及RA的病情活動性與關節破壞相關[6-16]。以上研究結果提示，miR146a有可能在RA的發病中起了非常重要的作用，可能有助于RA的診斷及病情活動性評估。

益賽普是目前國內應用較多的治療中重度RA的生物制劑，但對部分患者療效欠佳，且價格昂貴，遠遠超出多數RA患者的經濟承受能力。因此，如能提前判斷出可能對益賽普治療預期反應不好的RA患者，不再使用益賽普對這些RA患者進行治療，不但可減輕其經濟負擔，且有利于及時換用其他治療藥物，爭取更好的療效。

本研究結果顯示，接受益賽普治療的117例RA患者在治療結束時，達到臨床緩解新標準的RA患者只有91例，這91例RA患者PBMC中miR146a的表達水平顯著低于未達到RA臨床緩解新標準的患者，但miR155的表達水平無顯著性差異。

目前，多數臨床研究將RA的臨床緩解定義為DAS28評分不超過2.6分。由于疾病活動性評分28（DAS28）評分系統中疼痛關節數量的權重系數相對過大，故對于腫脹關節數目多于疼痛關節數目的RA患者，就顯得過于寬松。本研究中采用了EULAR與ACR共同制訂的RA的臨床緩解新標準，克服了DAS28的局限性，因此觀察結果更客觀且可靠[4]。

綜上所述，本研究結果初步表明，RA患者PBMC中miR146a的表達水平與益賽普治療RA的療效可能相關，且對于PBMC中具有較高miR146a表達水平的RA患者的療效更好。以后仍需更大的樣本進行驗證，以期通過先檢測miR146a的表達水平來預測益賽普治療RA的療效。

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