丹芪祛風散質量標準研究

唐斌斌，杜書君，韓子軍，苑學明 ，李建勇 ，郝保華

（1.山東省聊城市陽谷縣人民醫院，山東 聊城 252300； 2.山東省聊城市白癜風病診治重點實驗室，山東聊城 252000； 3.西北大學生命科學學院，陜西 西安 710069）

丹芪祛風散為治療白癜風的經驗方。祖國醫學稱白癜風為“白癜”“白駁風”“白駁”“白處”等[1-2]。《諸病源候論》指出，白癜風由“風邪搏于皮膚，血氣不和所生也”。《醫學金鑒·外科心法》指出：“此癥自面及頸項，肉色忽然變白，狀類癍點，并不癢痛。若因循日久，甚至延及全身。由風邪相搏于皮膚，致令氣血失和。”表明白癜風初期階段的表現特點與風邪有關，選方用藥上著重考慮祛風散邪，調和氣血[3-4]。丹芪祛風散由丹參、黃芪、白鮮皮等中藥組方，具有祛風補腎、調和氣血的功效，用于治療氣血失和證引起的白癜風效果良好，安全性好，未見明顯不良反應，但目前尚無質量標準。為確保其質量穩定和臨床有效，本研究按照《醫療機構制劑注冊管理辦法（試行）》要求，對丹芪祛風散進行了質量標準研究，并建立了處方中黃芪、白鮮皮的顯微鑒別方法，以及測定丹參中丹酚酸B含量的高效液相色譜法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilengt 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；WKF-30B型萬能粉碎機組（淄博史克制藥設備制造有限公司）；WKH-24-A型熱風循環烘箱（山東精誠醫藥裝備制造有限公司）；Olympus顯微鏡（日本歐林巴斯株式會社）；BSA224S型電子天平（賽多利斯科學儀器＜北京＞有限公司）。

1.2 試藥

丹酚酸B對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111562-201313）；丹芪祛風散（聊城市白癜風醫院制劑室，批號分別為 20160902，20160905，20160909）；甲醇和磷酸為色譜純，其他試劑均為分析純，試驗用水為雙蒸水。

2 方法與結果

2.1 黃芪、白鮮皮的顯微鑒別5111，302，6-8

取本品粉末，置顯微鏡下觀察，可見纖維成束或散離，兩端常斷裂成須狀或較平截（黃芪）；草酸鈣簇晶多數散在或存在于薄壁組織中（白鮮皮）。結果見圖1。顯微特征分別與黃芪、白鮮皮藥材一致，空白樣品（缺黃芪、白鮮皮）未檢出相應的顯微特征。

圖1 顯微鑒別特征（4×102）

2.2 丹酚酸B的含量測定

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Thermo C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 -0.1%磷酸溶液（20 ∶80）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：286 nm。理論板數按丹酚酸B峰計算應不低于2 000。通過DAD檢測器對供試品溶液中丹酚酸B進行全波長檢測，在擬訂色譜條件下，丹酚酸B主峰與其他雜質峰分離良好，丹酚酸B主峰的純度因子為999.92，在可接受的閾值內；供試品溶液中丹酚酸B主峰處無干擾。色譜圖見圖2。

圖2 系統適用性試驗高效液相色譜圖

2.2.2 溶液制備

對照品溶液：取丹酚酸B對照品適量，精密稱定，加甲醇-水（8∶2）溶液制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。

供試品溶液：取本品粉末約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-水（8∶2）混合溶液50 mL，密塞，稱定質量，超聲30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇-水（8∶2）混合溶液補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：取缺丹參藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別取2.2.2項下3種溶液，按擬訂色譜條件進樣，記錄色譜峰。結果表明，供試品溶液和丹酚酸B對照品溶液色譜在相同保留時間處有相應色譜峰，陰性無干擾，且分離度較好，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖3。

圖3 專屬性試驗高效液相色譜圖

線性關系考察：取丹酚酸B對照品，精密稱定，用甲醇 -水（8 ∶2）制成質量濃度分別為 1，5，10，20，50，100 μg/mL的標準溶液。按擬訂色譜條件，分別進樣10 μL，以質量濃度（C，μg/mL）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程 A=25.883C+11.153，r=0.999 6（n=6）。結果表明，丹酚酸 B 對照品溶液質量濃度在1～100 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取20 μg/mL丹酚酸B對照品溶液10 μL，重復進樣6次，測定峰面積。結果的 RSD為0.44%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液（批號為20160902），分別于 0，2，4，8，12，24 h 時進樣測定。結果峰面積平均值為 848.90，RSD 為 1.52% （n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取同一批（批號為20160902）樣品，按2.2.2項下方法制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件測定。結果丹酚酸B的平均含量為1.405 mg/g，RSD為0.70%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：稱取已知含量（批號為20160902，丹酚酸B含量為1.491 mg/g）的樣品6份，每份約0.8 g，精密稱定，分別精密加入質量濃度為0.105 5 g/L的丹酚酸 B對照品溶液各0.5 mL，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算回收率。結果見表1。

表1 丹酚酸B加樣回收試驗結果（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

取 3批樣品（批號分別為 20160902，20160905，20160909），按 2.2.2 項下方法制備供試品溶液，精密吸取樣品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進樣測定。結果 3批樣品中丹酚酸 B的含量分別為 1.426，1.618，1.380 mg/g（n=3）。

3 討論

3.1 定性鑒別

近年來，在低碳環保理念下，中醫藥研究和實際工作中顯微鑒別手段備受關注。丹芪祛風散保留了中藥飲片的固有顯微鑒別特征，本研究中首先嘗試顯微鑒別，參照2015年版《中國藥典（一部）》和文獻[9-11]中各味藥材的鑒別要點，其中黃芪和白鮮皮的特征明顯，易于觀察，缺黃芪和白鮮皮的陰性樣品中未檢出相應的顯微特征，其他藥材鑒別特點不明顯或有干擾。

對丹芪祛風散中飲片進行了薄層色譜鑒別，其中在蒺藜的薄層色譜鑒別中，曾用藥典方法以三氯甲烷-甲醇 -水（13：7：2）為展開系統，結果斑點有重疊，不能完全分離，集中于色譜圖的前1/3處。參考文獻[12]，改用石油醚（60～90℃ ）-乙酸乙酯 -甲酸（20 ∶1 ∶1）、正己烷-氯仿-乙酸乙酯[13]為展開系統，也不能有效分離。方中黃芪按藥典方法以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）為展開系統，在與對照品色譜相應位置上，日光下顯相同棕褐色斑點，紫外光燈（365 nm）下顯不同顏色的斑點。因顯微鑒別項已鑒別了黃芪，出于節約檢測成本和時限考慮，未進一步研究黃芪的薄層鑒別。

3.2 定量鑒別

建立高相液相色譜法時，考察了丹酚酸B的流動相乙腈 -0.1% 磷酸溶液（22 ∶78）[5]77、甲醇 -乙腈 -0.5% 甲酸（22 ∶10 ∶68）[14]和甲醇 -乙腈 -1% 冰醋酸水溶液（27 ∶13 ∶60）[15]，多次試驗后，適當調整，以乙腈-0.1%磷酸溶液（20∶80）為流動相，以流速為1.0 mL/min時，分離效果好，能消除丹酚酸B色譜峰前面的肩峰干擾，故選擇列入標準。

綜上所述，本研究中確立了丹芪祛風散中黃芪和白鮮皮的顯微鑒別方法和丹參中丹酚酸B的含量測定方法，試驗表明該方法操作簡單，靈敏度高，重復性好，專屬性強，可作為丹芪祛風散的質量控制方法。

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