蒽酮-硫酸顯色法測(cè)定栽培白及的白及多糖含量*

李德旺，鄧 芳，汪 勝

（湖南省衡陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖南 衡陽(yáng) 421001）

白及具有收斂、止血、清熱利濕、消腫生肌之功效，用于治療咳血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂、潰瘍出血等癥，富含白及膠[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，白及膠能抑制腫瘤血管生成，兼有抗感染、抗腫瘤和促進(jìn)凝血的功能[2-3]，其主要成分為大分子多糖[4]。2015年版《中國(guó)藥典（一部）》對(duì)白及的質(zhì)量控制僅見(jiàn)性狀、顯微鑒別和薄層色譜鑒別，未對(duì)白及中具有藥理活性的白及多糖進(jìn)行質(zhì)量控制。為評(píng)價(jià)栽培白及內(nèi)在質(zhì)量，本研究中采用蒽酮-硫酸顯色法測(cè)定其多糖含量，并與野生白及進(jìn)行比較，探討其變異性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent Cary60型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)安捷倫公司）；Mettler Ae 240型電子天平（瑞士梅特勒公司）；GZX-9146MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；TG16-Ⅱ型醫(yī)用離心機(jī)（湖南平凡科技有限公司）。

1.2 試藥

D-無(wú)水葡萄糖（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110833-201506，濃度為100%）；蒽酮（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20170706）；硫酸（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20170108）；試驗(yàn)用水為試驗(yàn)室自制純化水。野生白及（湖南衡岳中藥飲片有限公司，采于湖南南岳后山區(qū)，批號(hào)為171003，171004）；栽培白及（湖南衡岳中藥飲片有限公司中藥材種植基地，批號(hào)為 160901，160902，171001，171002）；市售白及（市場(chǎng)購(gòu)入，產(chǎn)地云南，批號(hào)為 20161201，170511），以上藥材均經(jīng)本中心副主任中藥師王先教鑒定為蘭科白及屬植物白及 Bletilla striata（Thunb.ex A.Murray）Rchb.f.的干燥塊莖，且符合藥典標(biāo)準(zhǔn)[5]。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

試液：0.2%蒽酮-硫酸溶液的配制，取蒽酮，精密稱(chēng)定0.301 2 g，加80%硫酸溶液100 mL使溶解，搖勻即得（棕色瓶保存或臨用時(shí)配制）。

對(duì)照品溶液：取 D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品，精密稱(chēng)定0.032 38 g，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液（D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品使用以100%計(jì)，即每1mL中含 D-無(wú)水葡萄糖0.3238mg）。

供試品溶液：取經(jīng)60℃干燥12 h的白及供試品粉末0.3 g，精密稱(chēng)定，置圓底燒瓶中，加入60 mL水，加熱回流提取1 h，趁熱用布氏漏斗濾過(guò)，殘?jiān)盁坑脽崴礈?次，每次10 mL，合并濾液和洗液，放冷，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，溶液濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液0.5 mL，加入4 mL丙酮，搖勻，靜置10 min，離心，傾去上清液，沉淀加水溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取2 mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下方法，自“在冰水浴中緩緩加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度”起，依法測(cè)定吸光度，計(jì)算百分含量。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

取對(duì)照品溶液，稀釋成0.009 7 g/L，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下方法顯色后，在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，色譜圖見(jiàn)圖1。選取最大吸收波長(zhǎng)582 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 D-無(wú)水葡萄糖紫外吸收光譜圖

2.3 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：精密量取對(duì)照品溶液 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，分別置 10 mL 具塞試管中，各加水至2.0 mL，混勻，在冰水浴中緩緩加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度，混勻，放冷后置水浴中保溫10 min，取出，立即置冰水浴中冷卻10 min，取出，以相應(yīng)試劑為空白。照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在582 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=24.11X-0.001，R2=0.996（n=6）。結(jié)果表明，D-無(wú)水葡萄糖質(zhì)量濃度在3.238～19.428 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液（0.097 1 g/L），按擬訂色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定。結(jié)果吸光度平均值為 0.252 9，RSD 為 0.12%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱(chēng)取樣品（批號(hào)為171001）6份，依法測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果平均含量為34.44%，RSD為0.32%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取白及（批號(hào)為171001），依法制備供試品溶液，分別于放置 20，40，60，90，120，150 min 后上樣測(cè)定。結(jié)果的 RSD為1.27%（n=6），供試品溶液在90 min內(nèi) D-無(wú)水葡萄糖吸光度基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為171001）精密稱(chēng)定0.3 g 6份，分別精密加入0.032 4 mg的 D-無(wú)水葡萄糖，依法測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 D-無(wú)水葡萄糖加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同批次白及多糖含量測(cè)定結(jié)果（以 D-無(wú)水葡萄糖計(jì)，n=6）

3 討論

3.1 顯色法選擇

考察了苯酚-濃硫酸顯色法，其樣品測(cè)定結(jié)果重復(fù)性較差，且苯酚毒性較大，易氧化，試驗(yàn)前需進(jìn)行純化處理[6-7]，操作煩瑣；而蒽酮-硫酸顯色法測(cè)定結(jié)果較穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便，故采用蒽酮-硫酸顯色法進(jìn)行測(cè)定。

3.2 樣品提取方法選擇

比較了以稀乙醇去雜質(zhì)再水提的方法與水提醇沉法測(cè)定白及多糖含量，2種方法測(cè)定結(jié)果較接近，但前者過(guò)濾時(shí)間太長(zhǎng)，后者操作簡(jiǎn)便，故選擇水提醇沉法。

3.3 方法優(yōu)勢(shì)

紫外分光光度法是一種常用的分析方法，應(yīng)用范圍廣，成本較低，操作快速、簡(jiǎn)便，同時(shí)具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性[8]；2015年版《中國(guó)藥典（一部）》白及項(xiàng)下的相關(guān)檢測(cè)項(xiàng)不能對(duì)其具有藥理活性的相關(guān)成分進(jìn)行相應(yīng)評(píng)價(jià)，方法精密度、重復(fù)性和準(zhǔn)確度良好，可作為評(píng)價(jià)其內(nèi)在質(zhì)量的參考方法。

3.4 樣品測(cè)定情況分析

結(jié)果顯示，栽培白及2年生樣品與3年生樣品相比，白及多糖含量差異顯著，栽培白及3年生樣品白及多糖含量與野生白及、市售白及相近，表明栽培白及采挖時(shí)限至少3年；結(jié)合其外在形態(tài)特征符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，表明該種植基地從野外引種的白及栽培變異不明顯，植物形態(tài)穩(wěn)定，野生引種塊莖繁殖的技術(shù)方法可行，可加大規(guī)模種植和推廣力度。同時(shí)，將繼續(xù)跟進(jìn)該種植基地，研究4年生、5年生白及的白及多糖含量，篩選效益最高、質(zhì)量最優(yōu)的種植方案。

[1]肖培根.新編中藥志（第一卷）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001：320.

[2]馮敢生，李 欣，鄭傳勝，等.中藥白芨提取物抑制腫瘤血管生成機(jī)制的試驗(yàn)研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2003，83（5）：412.

[3]徐小爐，尹 劉，程元芝，等.白芨栓塞治療中晚期肝癌的臨床觀察[J].實(shí)用癌癥雜志，2000，15（6）：640-641.

[4]羅新根，劉文庸，張衛(wèi)東.中藥白及的化學(xué)成分及臨床研究進(jìn)展[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，1999，17（6）：359.

[5]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：103.

[6]丁 玲，王 東，張中林，等.不同商品地山藥多糖含量的分析[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，11（4）：187-188.

[7]楊 春，楊金笛，林 帥.菊花、野菊花中的總糖含量測(cè)定[J].山西中醫(yī)，2009，24（6）：40-41.

[8]王 雷，楊新建，寇 欣.紫外分光光度法在中藥分析中的應(yīng)用進(jìn)展[J].天津藥學(xué)，2003，15（5）：62-64.