基于均勻設計的鎮(zhèn)靜催眠藥食兩用中藥復方篩選與驗證

朱 杰 ，于立芹 ，張華南 ，董建軍 ，徐如冰 ，李 建 ，全彥濤

（1.河南省生物技術開發(fā)中心，河南 鄭州 450002； 2.河南省植物天然產(chǎn)物開發(fā)工程技術研究中心，河南 鄭州 450002）

失眠通常是指患者對睡眠時間和（或）睡眠質量不滿足，并影響日間社會功能的一種主觀體驗，中醫(yī)學稱為“不寐”“不得眠”等[1]。失眠嚴重影響身心健康、生活質量和工作效率，導致機體免疫功能低下，增加代謝綜合征、肥胖及心血管疾病的發(fā)病風險[2]。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快及生活方式的改變，失眠日益成為突出的醫(yī)療及公共衛(wèi)生問題。預計到2020年，全世界受失眠困擾的人群將超過7億[3]。目前，治療失眠的藥物主要為鎮(zhèn)靜催眠藥，長期服用的安全性、藥物成癮性等風險較大，受到法律法規(guī)的嚴格限制。中醫(yī)治療失眠有獨特的優(yōu)勢，效果明顯，療效確切、可靠[4]。我國傳統(tǒng)醫(yī)學在長期實踐中發(fā)展出多種治療失眠的中藥復方與經(jīng)典方劑，且素有藥食同源、藥補不如食補的說法，從藥食兩用中藥中篩選具有抗失眠作用的復方，不僅符合人們?nèi)粘ｏ嬍潮＝⌒枨螅野踩暂^高，是當前研究的熱點。本研究中采用均勻設計法從治療失眠經(jīng)方中篩選防治失眠的藥食兩用中藥配方，以延長戊巴比妥鈉誘導睡眠時間為藥效學指標，觀察不同藥物配比對鎮(zhèn)靜催眠作用的影響，探討藥食兩用中藥配伍及相互作用，優(yōu)化其配伍藥味及劑量水平。

1 材料與方法

1.1 動物、試藥與儀器

動物：SPF級雌性昆明種小鼠270只，4周齡，體質量18～22 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（湘）2016-0002。試驗期間自由飲水和攝食，12 h晝夜節(jié)律變換，相對濕度50%～70%，溫度（23±1）℃。試驗過程中對動物的處置符合動物倫理學原則。

試藥：百樂眠膠囊（揚子江藥業(yè)集團有限公司，批號為 17032841，規(guī)格為每粒 0.27 g）；戊巴比妥鈉（上海西唐生物科技有限公司，批號為20170527，純度＞99%）；炒酸棗仁為鼠李科植物酸棗 Ziziphus jujuba Mill.var.Spinosae （Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子，產(chǎn)自廣西；百合為百合科植物卷丹 Lilium lancifolium Thunb，百 合 Lilium brownii F.E.Brown var.viridulum Baker或細葉百合L.pumilum DC.的干燥肉質鱗莖，產(chǎn)自浙江；阿膠為馬科動物驢的皮經(jīng)煎熬、濃縮而成的干燥膠塊，產(chǎn)自山東；茯苓為多孔菌科真菌 Wolfiporiacocos（Schwein.）的干燥菌核，產(chǎn)自云南；甘草為豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.，脹果甘草 Glycyrrhiza inflate Bat.或光果甘草 Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根莖，產(chǎn)自內(nèi)蒙古；大棗為鼠李科植物棗 Ziziphus jujuba Mill.的干燥成熟果實，產(chǎn)自河南。以上中藥材均購自河南省世通醫(yī)藥有限公司，經(jīng)河南省生物技術開發(fā)中心趙天增研究員鑒定為正品，經(jīng)檢測均符合2015年版《中國藥典（一部）》相關項下要求。

儀器：CP224C 型電子天平（精度為 0.1 mg），STX2201型便攜式天平精度為0.1 g，均購自奧豪斯儀器＜上海＞有限公司；SB2100型旋轉蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

組方設計：采用均勻設計法安排試驗，選用 U*10（108）均勻設計表，以酸棗仁、百合、阿膠、茯苓、大棗、甘草6味藥材為考察因素，每味藥物設置10個劑量水平，共有10種配伍組合（見表1）。各藥材試驗劑量范圍最小值均為0，表示該藥味缺失，最高值參考2015年版《中國藥典（一部）》藥材項下用法與用量制訂。各組合按照表1中的藥材量比例準確稱量（阿膠除外），將各飲片混合，加10倍量水，煮沸1 h，過濾后濾渣加8倍量水，煮沸40 min，濾過，合并2次濾液，旋轉蒸發(fā)干燥。試驗前將提取物以適量水溶解，在不低于60℃溫度條件下按比例加入阿膠粗粉，攪拌烊化5 min，待溫度下降調整藥液體積后使用。

表1 藥食兩用中藥配伍均勻試驗設計（g）

分組與給藥：將小鼠隨機分為12組，每組10只，分別為組方1組至組方10組、空白對照組、百樂眠組。組方1組至組方10組根據(jù)出膏率折算小鼠給藥劑量，分 別 為 1.26，1.63，1.89，1.49，1.16，1.19，0.99，0.66，0.84，0.66 g/kg，百樂眠組給百樂眠膠囊劑量為0.31 g/kg，空白對照組灌胃生理鹽水。各組小鼠灌胃體積均為10 mL/kg。

直接睡眠試驗：小鼠分組與各組給藥按“分組與給藥”項下方法，連續(xù)灌胃15 d，觀察給藥后是否出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象。睡眠以翻正反射消失為指標；當小鼠置背臥位時，能立即翻正身位；如超過30～60 s不能翻正者，即認為翻正反射消失，進入睡眠；翻正反射恢復即為動物覺醒，翻正反射消失至恢復這段時間為動物睡眠時間。記錄空白對照組與各給藥組入睡動物數(shù)。

延長戊巴比妥鈉誘導睡眠時間試驗：小鼠分組與各組給藥方法同按“分組與給藥”項下操作，連續(xù)灌胃15 d，給藥后30 min，各組動物腹腔注射戊巴比妥鈉60 mg/kg，以翻正反射消失為指標，觀察受試樣品能否縮短入睡潛伏期或延長戊巴比妥鈉誘導睡眠時間。以小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉時至翻正反射消失這段時間記為睡眠潛伏期，以翻正反射消失至恢復這段時間記為睡眠時間。

戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗：小鼠分組與各組給藥方法同按“分組與給藥”項下操作，連續(xù)灌胃15 d，給藥后30 min，各組動物腹腔注射戊巴比妥鈉最大閾下催眠劑量40 mg/kg，記錄30 min內(nèi)入睡動物數(shù)（翻正反射消失達1 min以上者）。

臟器指數(shù)測定：試驗結束后處死小鼠，剝離脾臟、胸腺，準確稱定質量，計算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)（%）=器官質量（g）/體質量（g）×100%。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（±s）表示，經(jīng)正態(tài)分布檢驗后進行比較，組間比較采用單因素方差分析（One way ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。均勻試驗設計的配伍配比采用DPS軟件處理進行多元回歸分析。

2 結果

2.1 對大鼠體質量的影響

試驗開始前及結束時對小鼠體質量進行統(tǒng)計和分析，結果見表2。各給藥組小鼠初始體質量與空白對照組相比無顯著性差異（P＞0.05），即各組小鼠的初始體質量較均衡；試驗結束時，各給藥組小鼠體質量與空白對照組相比均無顯著性差異（P＞0.05）。結果表明，各受試藥物對小鼠體質量增長無影響。

2.2 對小鼠臟器指數(shù)的影響

由表3可知，各受試藥物給藥組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)與空白對照組相比無顯著性差異（P＞0.05），表明各受試藥物對小鼠免疫器官無影響。

表2 各組小鼠體質量比較（±s，g，n=20）

表2 各組小鼠體質量比較（±s，g，n=20）

組別組方1組組方2組組方3組組方4組組方5組組方6組初始21.1 ± 2.5 21.4 ± 2.7 21.1 ± 2.7 21.2 ± 2.2 21.2 ± 2.7 21.2 ± 2.2試驗末28.3 ± 2.4 31.1 ± 2.1 29.6 ± 2.6 32.1 ± 4.9 31.4 ± 4.0 31.0 ± 4.1組別組方7組組方8組組方9組組方10組百樂眠組空白對照組初始21.2 ± 2.2 21.2 ± 2.7 20.9 ± 2.5 20.9 ± 2.0 21.2 ± 2.2 21.0 ± 2.5試驗末30.4 ± 2.9 30.4 ± 2.7 28.6 ± 4.6 28.0 ± 1.9 31.0 ± 2.7 30.2 ± 3.4

表3 各組小鼠臟器指數(shù)比較（±s，%，n=20）

表3 各組小鼠臟器指數(shù)比較（±s，%，n=20）

組別組方1組組方2組組方3組組方4組組方5組組方6組組方7組組方8組組方9組組方10組百樂眠組空白對照組胸腺指數(shù)0.26 ± 0.03 0.28 ± 0.05 0.26 ± 0.05 0.28 ± 0.07 0.28 ± 0.04 0.26 ± 0.07 0.28 ± 0.06 0.22 ± 0.04 0.25 ± 0.05 0.23 ± 0.05 0.25 ± 0.06 0.22 ± 0.05脾臟指數(shù)0.30 ± 0.05 0.30 ± 0.04 0.27 ± 0.10 0.32 ± 0.06 0.28 ± 0.10 0.26 ± 0.07 0.28 ± 0.07 0.32 ± 0.04 0.26 ± 0.08 0.31 ± 0.07 0.28 ± 0.10 0.27 ± 0.08

2.3 對小鼠的直接睡眠作用的觀察結果

小鼠給予受試藥物后，觀察60 min內(nèi)小鼠活動情況，各給藥組與空白對照組小鼠均無睡眠現(xiàn)象發(fā)生，活動正常，表明各受試藥物及百樂眠膠囊均無直接睡眠作用。

2.4 對延長戊巴比妥鈉誘導睡眠時間的影響

由表4可知，除組方2組外，其他各受試藥物給藥組及百樂眠組小鼠睡眠潛伏期顯著縮短（P＜0.05），其中組方3組與組方10組小鼠睡眠潛伏期較百樂眠組顯著縮短（P=0.035，0.029）。與空白對照組相比，組方2組、組方 5組小鼠睡眠時間顯著縮短（P=0.001，0.039），表明這兩組藥物配比對睡眠產(chǎn)生了抑制作用；組方8組、組方9組與組方10組小鼠睡眠時間顯著延長（P＜0.05），提示其有顯著促進睡眠的作用。

2.5 對戊巴比妥鈉閾下劑量催眠效果的影響

各受試藥物對戊巴比妥鈉閾下劑量催眠效果的影響見表5。可見，除組方2組、組方4組、組方7組外，其他各受試給藥組均可增加閾下催眠劑量戊巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠只數(shù)，表明酸棗仁、百合、阿膠、茯苓、甘草、大棗在一定比例配伍時與戊巴比妥鈉可能產(chǎn)生了協(xié)同作用。

2.6 多元回歸處理

將睡眠時間進行DPS軟件處理，經(jīng)多元回歸，得回歸 方程 Y=1 210-19.37X2+67.52X1X1-21.77X1X3-16.95 X1X5-12.89 X2X5-3.694 X3X4-2.980 X4X5+24.49X5X6，r=1.000 0，F(xiàn)=62 499.906 3，回歸顯著性檢驗（P=0.003 1）。說明該方程能較好地擬合各藥材對睡眠時間產(chǎn)生的影響，提示酸棗仁、甘草、大棗配伍具有延長睡眠時間的作用，其中酸棗仁作用最強。優(yōu)化組方結果：酸棗仁 9.0 g，百合 4.9 g，茯苓3.5 g，大棗2.4 g，甘草 0.18 g。即酸棗仁、百合、茯苓、大棗、甘草的最佳配比為 50 ∶27 ∶19 ∶13 ∶1，生藥劑量為 0.87 g/kg。

表4 各組小鼠延長戊巴比妥鈉誘導睡眠時間的比較（±s，min，n=10）

表4 各組小鼠延長戊巴比妥鈉誘導睡眠時間的比較（±s，min，n=10）

注：與空白對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與百樂眠組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01。

組別組方1組組方2組組方3組組方4組組方5組組方6組組方7組組方8組組方9組組方10組百樂眠組空白對照組睡眠潛伏期3.87 ± 0.88**4.37 ± 0.91 3.33 ± 0.77**▲3.39 ± 0.72**3.99 ± 0.45*4.12 ± 0.73*3.72 ± 0.37**3.51 ± 0.58**3.42 ± 0.60**3.31 ± 0.56**▲4.10 ± 0.71*4.84 ± 0.75▲睡眠時間49.94 ±10.79 22.79 ±9.10**▲▲38.24 ±11.07▲▲32.66 ±6.15▲▲30.44 ±16.00*▲▲40.34 ±16.11▲▲38.54 ±13.90▲▲71.10 ±11.65**58.09 ±7.92*70.20 ±14.61**61.92 ±10.84**43.18 ±11.77▲▲

表5 各組小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠效果的比較（n=10）

2.7 優(yōu)化組方驗證

由表6可知，優(yōu)化組方組按1.2項下“延長戊巴比妥鈉誘導睡眠時間試驗”相關操作，連續(xù)灌胃15 d后，平均延長戊巴比妥鈉誘導睡眠時間顯著高于空白對照組與百樂眠組（P=0.000），表明其具有鎮(zhèn)靜催眠作用，且藥效顯著優(yōu)于百樂眠膠囊。

3 討論

中醫(yī)對失眠的認識源遠流長，有著數(shù)千年的治療經(jīng)驗，臨床療效也得到了廣泛肯定。本研究中所篩選的藥食兩用藥材主要來源于4個經(jīng)典方劑，分別為酸棗仁湯、黃連阿膠湯、百合地黃湯與甘麥大棗湯，均出自張仲景《傷寒雜病論》，經(jīng)方常聯(lián)合應用于失眠的臨床治療[5-7]。酸棗仁湯為治療虛勞心煩失眠的經(jīng)典方劑，方中酸棗仁養(yǎng)心陰、益肝血，有安神之效，為養(yǎng)心安神之要藥，常用于心血虧虛、心失所養(yǎng)、神不守舍之失眠，在臨床失眠病方劑中使用頻率最高[8]，后世醫(yī)家也在酸棗仁湯基礎上化裁治療各種失眠常見證候類型。甘麥大棗湯屬滋養(yǎng)安神劑，用于治療陰血不足之失眠不安，其重用小麥補心養(yǎng)肝，除煩安神，配甘草、大棗益氣和中，潤燥緩急。黃連阿膠湯和百合地黃湯滋陰清熱，主治陰虛內(nèi)熱導致的失眠。

表6 3組小鼠延長戊巴比妥鈉誘導睡眠時間比較（±s，min，n=10）

表6 3組小鼠延長戊巴比妥鈉誘導睡眠時間比較（±s，min，n=10）

注：與空白對照組比較，*P＜0.01。

組別空白對照組百樂眠組優(yōu)化組方組睡眠潛伏期4.66 ± 0.44 3.74 ± 0.19*3.57 ± 0.51*睡眠時間33.41 ± 3.40 70.62 ± 10.4*106.0 ± 8.65*

百樂眠膠囊能有效改善失眠狀況，緩解焦慮癥狀，無耐藥性與藥物成癮性[9]，故本研究中選擇百樂眠膠囊作為陽性對照。本研究結果表明，酸棗仁用量與睡眠時間呈正相關，百合對睡眠時間呈負向作用，酸棗仁、阿膠，酸棗仁、甘草，百合、甘草，阿膠、茯苓配伍，具有拮抗作用，大棗、甘草配伍具有協(xié)同增效作用，酸棗仁、百合、茯苓、甘草、大棗是本研究中抗失眠的最佳配伍組方，驗證試驗提示，篩選得到的最佳配伍組方合理，具有顯著的鎮(zhèn)靜催眠作用。

現(xiàn)代藥理學研究表明，酸棗仁中以皂苷、黃酮類化合物為主要活性物質，具有鎮(zhèn)靜催眠作用[10]。其作用機制可能與抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)爆發(fā)式放電及維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)遞質的興奮與抑制平衡有關[11]。酸棗仁湯中分別去掉川芎、知母和甘草后可顯著減少小鼠自發(fā)活動[12]，推測原方中川芎、知母和甘草無明顯鎮(zhèn)靜作用，而起到鎮(zhèn)靜作用的是酸棗仁和茯苓。百合既是食品又是藥品，可養(yǎng)陰潤肺止咳、清心安神。現(xiàn)代藥理研究表明，百合水提取液可顯著縮短小鼠入睡時間[13]，且百合皂苷可顯著延長戊巴比妥鈉誘導的睡眠時間[14]，因此具有良好的鎮(zhèn)靜催眠作用，但本研究結果未顯示百合與其他藥材配伍對睡眠有顯著促進作用。甘草、大棗為張仲景使用頻率極高的藥對，在經(jīng)方配伍中具有化陽助氣、解毒和藥、緩肝之急的功效[15]。甘麥大棗湯能延長戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠時間，顯著抑制小鼠自發(fā)活動[16-17]，具有鎮(zhèn)靜催眠作用，推測大棗、甘草配伍對睡眠有促進作用。

綜上所述，本研究中通過均勻設計法篩選出了具有鎮(zhèn)靜催眠作用的藥食兩用中藥配方，且其鎮(zhèn)靜催眠作用優(yōu)于百樂眠膠囊，但其鎮(zhèn)靜催眠的機制和配伍機制尚需進一步研究。隨著人們健康保健意識的增強、非感染性慢性疾病的增長和醫(yī)療費用的日益攀升，將“疾病的防治重心前移”已成為政府和業(yè)界的共識[18]。“治未病”思想是中醫(yī)理論的重要組成部分，也是非常具有中醫(yī)特色的疾病預防理論，采用藥食兩用中藥治療失眠對于預防疾病進展及其他疾病具有重要意義。

[1]中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會睡眠障礙學組.中國成人失眠診斷與治療指南[J].中華神經(jīng)科雜志，2012，45（7）：534-540.

[2]Taylor DJ，Lichstein KL，Durrence HH.Insomnia as a health risk factor[J].Behav Sleep Med，2003，1（4）：227-247.

[3]Drake CL，Roehrs T，Roth T.Insomnia causes，consequences，and therapeutics：an overview[J].Depress&Anxiety，2003，18（4）：163-176.

[4]李建霞.中醫(yī)治療失眠癥的臨床研究進展[J].中國處方藥，2017，15（2）：18-19.

[5]王旭玲，張曉昀，原凡惠，等.酸棗仁湯合甘麥大棗湯加減治療更年期不寐[J].吉林中醫(yī)藥，2012，32（7）：701.

[6]仇燕飛.黃連阿膠湯合甘麥大棗湯治療更年期失眠50例[J].河南中醫(yī)，2015，35（8）：1764-1766.

[7]利順欣.百合地黃湯合酸棗仁湯加味治療老年失眠[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育，2014，12（20）：48-49.

[8]吳嘉瑞，張 冰，楊 冰，等.基于關聯(lián)規(guī)則和復雜系統(tǒng)熵聚類的顏正華診療失眠用藥規(guī)律研究[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（24）：1-5.

[9]麥 覺.百樂眠膠囊治療頑固性失眠30例療效觀察[J].中國醫(yī)藥導報，2009，6（28）：74-75.

[10]吳玉蘭，許惠琴，陳 詵.酸棗仁不同炮制品及炒酸棗仁中總黃酮與總皂苷的鎮(zhèn)靜催眠作用比較[J].時珍國醫(yī)國藥，2005，16（9）：868-869.

[11]壽彩華.酸棗仁皂苷A對實驗大鼠的中樞鎮(zhèn)靜抑制作用及機制研究[D].杭州：浙江大學，2002.

[12]封 碩.酸棗仁湯君臣佐使配伍的藥效學研究[D].沈陽：遼寧中醫(yī)藥大學，2007.

[13]胡煥萍，張 劍，甘銀凰，等.單味新鮮百合止咳鎮(zhèn)靜催眠等作用藥理實驗[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，17（9）：1704-1705.

[14]李海龍，高淑怡，高 英，等.百合知母總皂苷鎮(zhèn)靜催眠的藥效學研究[J].北方藥學，2012，9（10）：34-36.

[15]熊 亮，黃秀深.仲景方甘草大棗配伍功用淺析[J].新疆中醫(yī)藥，2007，25（增刊）：76-78.

[16]李 俊，袁燦興，林秀鳳，等.甘麥大棗湯及其不同加味對小鼠鎮(zhèn)靜催眠作用的比較[J].上海中醫(yī)藥雜志，2003，37（8）：6-8.

[17]覃文才，洪庚辛，饒 芳.甘麥大棗湯的中樞抑制作用[J].中藥藥理與臨床，1994，5（5）：9-11.

[18]孫有智，羅 暢，趙 益.“治未病”思想在疾病預防應用中的問題及對策[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2016，22（12）：1633-1634.