腎透明細胞癌差異表達基因及其關鍵通路的生物信息學分析

（南方醫科大學南方醫院 廣東 廣州 510515）

孫雅玲 陳龍華(通訊作者)

1.背景介紹

腎細胞癌簡稱腎癌，起源于腎小管上皮細胞，是泌尿系統常見的惡性腫瘤之一，其中腎透明細胞癌為最主要的類型，約占腎細胞癌的75%[1]。腎透明細胞癌起病隱匿，約30%患者診斷時已為晚期，失去手術機會，而腎透明細胞癌對于放療及化療均不敏感。目前臨床應用中尚無可靠的診斷標記物，因此檢測腎細胞癌差異表達基因，尋找分子診斷標記物及潛在臨床治療靶點具有重要意義。

腎透明細胞癌的發生發展是一個多基因多步驟的過程，而高通量測序技術的發展及基因芯片的出現為研究腎透明細胞癌基因表達譜情況提供了基礎。本研究利用GEO數據庫中的腎透明細胞癌基因芯片進行生物信息學分析，以期獲取腎透明細胞癌相關的關鍵基因，為后續尋找分子標記物及治療靶點提供理論基礎。

2.材料和方法

2.1 芯片數據獲取

從GEO中下載腎透明細胞癌基因表達譜芯片GSE46699，該芯片基于GPL571 平臺（[HG-U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array），共有130例腎透明細胞癌及正常腎組織樣本，本研究選取其中32例非吸煙非肥胖腎透明細胞癌患者樣本和28例非吸煙非肥胖正常對照樣本進行分析。

2.2 數據預處理與差異表達基因分析

數據處理和分析使用R軟件進行。對原始表達數據使用RMA算法進行標準化，使用“Limma”包篩選在腎透明細胞癌及正常腎組織中差異表達的基因，差異基因篩選標準：校正后P值(adjustP-value) ＜ 0.05，|logFC|＞ 1。

2.3 GO和KEGG分析

通過DAVID數據庫對差異表達基因在GO中注釋其參與的生物學過程，并進行KEGG通路富集分析。以P＜0.05作為顯著性閾值。

2.4 蛋白互作網絡構建及樞紐基因篩選

使用STRING數據庫對差異表達基因對應蛋白質進行相互作用關系分析，以此構建蛋白互作網絡圖并用Cytoscape軟件進行可視化，通過計算單個蛋白質節點與其他節點間的關系強度來篩選排名前20的樞紐基因。

3.結果

3.1 差異表達基因篩選結果

在GSE46699芯片中根據篩選標準共得到848個差異基因，其中上調基因有384個，下調基因有464個，差異表達基因熱圖見圖1。

圖1 差異表達基因熱圖

3.2 GO功能富集分析

采用DAVID數據庫對848個差異基因所參與的生物學過程進行分析，結果顯示差異基因主要涉及免疫反應、防御反應、炎癥反應、血管形成等過程（圖2）。

圖2 差異表達基因功能富集分析

3.3 差異表達基因的KEGG通路分析

利用DAVID數據庫對差異基因進行KEGG通路分析，結果顯示差異基因主要集中在細胞黏附分子、氨基酸代謝降解、PPAR信號通路等通路中（圖3）。

圖3 差異表達基因KEGG通路分析

3.4 蛋白互作網絡和樞紐基因

通過STRING數據庫對差異表達基因對應蛋白產物的相互作用關系進行分析，并應用Cytoscape軟件構建蛋白質相互作用網絡（圖4）。進一步計算每個節點與其他節點相關的數目并由高到低進行排序，獲得排名前20的樞紐基因，包括COL1A1、COL1A2、COL6A2、COL6A3、COL4A2、COL4A4、COL4A5、COL4A3、COL3A1、COL5A2、COL5A1、COL8A1、COL15A1、COL23A1、COL21A1、DCN、FN1、CCL5、CXCR4、CXCL9。

圖4 蛋白相互作用網絡圖

4.討論

腎透明細胞癌是泌尿系統最常見的原發性腫瘤，約占實體瘤的3%，它具有發展快，易轉移，易復發等特點，且對放化療及內分泌治療均不敏感。腎透明細胞癌的發生發展是一個多基因參與，涉及多個步驟的過程，目前其具體的分子生物學機制尚不清楚。為進一步了解腎透明細胞癌發生發展的分子機制，篩選可作為臨床診斷的關鍵基因和潛在治療靶點，本研究以腎透明細胞癌為研究對象，通過生物信息學方法對GEO數據庫相關芯片GSE46699進行分析，篩選差異表達基因并對差異基因進行功能注釋、通路分析和對應蛋白質相互作用關系分析。

通過將腎透明細胞癌組織測序信息和正常組織測序信息進行比較，共篩選出848個差異表達基因，其中包括384個上調基因，464個下調基因。使用STRING數據庫對差異基因編碼的蛋白質之間的相互作用進行分析，構建出了以COL1A1、COL1A2、COL6A2、COL6A3、COL4A2、COL4A4、COL4A5、COL4A3、COL3A1、COL5A2、COL5A1、COL8A1、COL15A1、COL23A1、COL21A1、DCN、FN1、CCL5、CXCR4、CXCL9等為中心節點形成的蛋白互相作用網絡。對以上樞紐基因進行文獻檢索，發現其中一些基因與腫瘤的發生發展關系密切。COL1A1、COL1A2基因分別編碼I型膠原纖維的α1鏈和α2鏈，而I型膠原纖維參與形成細胞外基質，對于細胞的粘附及分化有重要作用，此外，COL5A1、COL8A1、FN1等也均為細胞粘附相關基因。和正常細胞相比，腫瘤細胞間的粘附作用普遍降低，促進了腫瘤細胞的遷移。在腎透明細胞癌中，研究發現COL1A1、COL5A1、COL8A1、FN1表達升高且與患者的不良預后相關，在腎癌細胞株Caki-2中，外源性補充TGF-β1可上調COL1A1、COL5A1、COL8A1、FN1的表達[2]。因此，細胞粘附性的改變可能在腎透明細胞癌的發生發展過程中發揮了重要作用。

在這20個樞紐基因中，CCL5、CXCR4、CXCL9與炎癥及免疫密切相關，其中CCL5是CC趨化因子亞家族成員，CXCL9是CXC趨化因子亞家族成員，CXCR4是CXC趨化因子受體之一。炎癥及免疫反應在腫瘤的發生發展中扮演著重要角色，其中，CXC趨化因子配體及其受體被發現可以調節腫瘤相關血管生成，影響腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移等生物學行為，調節腫瘤細胞與免疫細胞間的相互作用。在腎癌中，多種趨化因子配體及其受體的表達水平均發生了改變，且與腫瘤分期及患者預后顯著相關，有可能成為新型診斷及預后分子標志物[3]，其中CXCR4的高表達被證實是腎透明細胞癌患者預后的獨立危險因素，其結合TNM分期構建的列線圖預測模型可以更準確地預測患者的總生存時間[4]。在伴有轉移的腎癌病人外周血中分離出細胞角蛋白陽性的循環腫瘤細胞，其表面也可見CXCR4表達，且CXCR4在腎癌組織的表達程度與腫瘤轉移能力直接相關，在小鼠體內抑制CXCL12/CXCR4軸可以廢止腎透明細胞癌向其它組織的轉移[5]。包括CXCL9在內的干擾素誘導產生的CXCR3配體可以參與免疫調節及血管生成[6,7]，在腎癌小鼠模型中聯用IL-2和CXCL9可以抑制腫瘤生長，減少腫瘤血管生成，增加CXCR3陽性單核細胞向腫瘤的浸潤[8]。在臨床上，基于CXCL9等因素構建的ICL評分可以預測無轉移腎透明細胞癌患者術后復發風險[9]。

CCL5作為一種趨化因子，主要趨化單核細胞、中性粒細胞等細胞向炎癥部位遷移，近年來，CCL5/CCR5軸在腫瘤中的生物學作用引起了廣泛關注。研究發現CCL5/CCR5軸可以參與免疫調節，并與多種腫瘤的進展密切相關[10,11]。在腎透明細胞癌中，患者血清中CCL5的濃度被證實明顯升高，同時CCL5在腎透明細胞癌組織樣本中的蛋白表達水平也顯著上調，并與患者的臨床病理分期正相關，與總生存時間負相關[12]，這提示CCL5有可能成為腎透明細胞癌患者預后判斷的分子學指標。此外，CCL5介導了骨髓間充質干細胞對于腎透明細胞癌生物學行為的調控，特異性阻斷CCL5可以顯著抑制腎癌細胞的侵襲、遷移并可以延長荷瘤小鼠的總生存時間，CCL5有望成為腎透明細胞癌臨床治療的潛在新靶點[13]。

綜上所述，本研究應用生物信息學方法對腎透明細胞瘤基因芯片數據進行了挖掘，篩選出腎透明細胞癌與正常腎組織差異表達基因并從生物學功能、參與通路等多角度進行分析，進一步甄別出20個樞紐基因，從分子水平為探討腎透明細胞癌發生發展機制提供了理論依據，同時也為腎透明細胞癌早期診斷及靶向治療提供了潛在線索，但這些關鍵基因的具體作用及相關機制后期還需要進一步的實驗驗證。

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