復(fù)合酶法優(yōu)化黃芪多糖的提取工藝研究

鄧智月 張乾旭 李婧

（1廣東省中醫(yī)院藥劑科 廣東 廣州 510120）

（2廣州中醫(yī)藥第一附屬醫(yī)院科研處 廣東 廣州 510405）

黃芪（Astragalus membranaceus）為中藥中常用的補(bǔ)氣藥，是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根[1]。作為一種傳統(tǒng)中藥材，其含有多種對(duì)人體有益的生物成分，例如黃芪皂苷、胡蘿卜素、葉酸等[2]。黃芪具有補(bǔ)氣升陽，益衛(wèi)固表，托毒生肌，利水消腫的功效[3]。上能升陽舉陷，治療中氣下陷，久瀉脫肛等證，下能利水消腫，治療氣虛水腫，內(nèi)能補(bǔ)氣，益衛(wèi)固表止汗，治療表虛自汗，外能托毒生肌，治療癰疽難潰，久潰不斂等。現(xiàn)代藥理研究表明，黃芪除了能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，還能黃芪有強(qiáng)心、限制或縮小心肌梗死面積，以及改善心肌炎癥狀、抗應(yīng)激、抗心肌缺血的作用[4]，能擴(kuò)張血管，擴(kuò)張冠脈、降低血壓，改善心肌氧的代謝平衡。促進(jìn)細(xì)胞代謝，雙向調(diào)節(jié)血糖濃度。另外，具有抗腫瘤、抗衰老的功能等等[5]。因此，對(duì)于黃芪多糖提取與優(yōu)化，對(duì)于進(jìn)一步探究其藥理學(xué)作用具有重要意義。

目前，黃芪多糖提取工藝主要有回流提取法、煎煮法、醇水提取法、酶提取法、超聲波提取法、微波提取法等[6]。上述提取方法存在耗時(shí)耗力、收率低、產(chǎn)物雜質(zhì)多缺點(diǎn)[7]。本次研究選取具有操作簡單、條件溫和、提取效率高、環(huán)境友好等特點(diǎn)[8-9]酶提取法，通過單因素和L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以黃芪多糖含量為考察指標(biāo)，以酶解溫度、酶濃度、酶解時(shí)間及酶解pH對(duì)多糖得率的影響為試驗(yàn)因素，優(yōu)選黃芪多糖的提取工藝，為黃芪多糖的進(jìn)一步深入研究提供依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）；SB-3200DTD超聲波清洗器（寧波新芝生物科技有限公司）；UV-1800 紫外可見光分光光度計(jì)（日本島津公司）；R-1001N 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會(huì)社）；BP211D電子天平（德國賽多利斯公司）；DGH80-B 恒溫干燥箱（北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司）。

黃芪購買自北京同仁堂，產(chǎn)地為內(nèi)蒙古包頭；實(shí)驗(yàn)中所用蒸餾水均為市售屈臣氏蒸餾水；葡萄糖（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，分析純）；苯酚、濃硫酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純）；中性蛋白酶（酶活力≥100U/mg）、纖維素酶（酶活力≥400U/mg），（大連美侖生物技術(shù)有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱量葡萄糖對(duì)照品20mg置于100mL容量瓶中，溶解并稀釋至刻度，混勻后即得0.2mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。精密吸取適量葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，用蒸餾水分別稀釋至0、5、10、20、40、60、80μg/mL，采用苯酚-硫酸法測定多糖濃度。紫外可見分光光度計(jì)在490nm下測定其吸光度（A）。按照葡萄糖質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：A=0.6275C-0.721，R=0.9993。測定多糖質(zhì)量濃度線性范圍是0～80μg/mL。見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.2 樣品處理方法 準(zhǔn)確稱量黃芪藥材粉末10.0g，加入復(fù)合酶，調(diào)節(jié)pH，水浴加熱。反應(yīng)結(jié)束后，沸水浴10min將酶滅活，抽濾，濾液定容至250mL，作為供試品溶液。按照上述方法測定多糖濃度。

多糖收率（%）=[多糖含量/（1000×黃芪藥材粉末質(zhì)量）]×100

其中多糖濃度單位為μg/mL，黃芪藥材粉末質(zhì)量單位為mg。1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用單因素實(shí)驗(yàn)考查，以纖維素酶：中性蛋白酶=1:1的復(fù)合酶，考查酶解溫度（30、35、40、45、50、55、60℃），酶濃度（4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%）、酶解時(shí)間（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5h）和酶解pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）對(duì)黃芪多糖提取效果的影響，選擇合適的提取條件。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 復(fù)合酶法正交試驗(yàn)以酶解溫度（A）、酶濃度（B）、酶解時(shí)間（C）、酶解pH（D）為試驗(yàn)因素，每個(gè)因素下設(shè)計(jì)3個(gè)水平，根據(jù)L9（34）正交表安排試驗(yàn)，以黃芪多糖含量為指標(biāo)，優(yōu)選黃芪多糖的提取工藝。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2.結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照葡萄糖質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，溶液在490nm處的吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：A=0.6275C-0.721，R=0.9993。測定總糖質(zhì)量濃度線性范圍是0～80μg/mL。

2.2 單因素和正交試驗(yàn)結(jié)果

單因素結(jié)果表明，酶解溫度、酶濃度、酶解時(shí)間、酶解pH對(duì)于黃芪多糖含量均有影響，其中酶解溫度小于50℃時(shí)，隨溫度增高，多糖得率增多，溫度大于55℃時(shí)，多糖得率下降，說明此時(shí)酶活性降低。酶濃度在5.5%以下時(shí)，得率屬于上升狀態(tài)，而大于5.5%時(shí)，復(fù)合酶會(huì)對(duì)黃芪多糖進(jìn)行分解，降低提取效率。酶解時(shí)間大于3.5h時(shí)，同樣也會(huì)使多糖分解。復(fù)合酶在偏酸性條件下pH6.0時(shí)活性最好。

由表2試驗(yàn)結(jié)果可知，對(duì)黃芪多糖的提取效果的影響順序?yàn)椋好笣舛龋˙）＞酶解溫度（A）＞酶解時(shí)間（C）＞酶解pH（D），即復(fù)合酶濃度對(duì)黃芪多糖的提取效果影響最大，酶解溫度次之，酶解時(shí)間和酶解pH影響較小。以黃芪多糖的得率為考察指標(biāo)，4因素3水平最佳酶解提取工藝條件為：酶解溫度50℃，酶濃度5.5%，酶解時(shí)間3.5h，酶解pH6.0時(shí)，其提取效果最佳。在此提取工藝條件下，重復(fù)三次進(jìn)行最優(yōu)提取條件的驗(yàn)證，黃芪多糖含量占原藥材的8.58%，RSD=1.57%（n=3）。結(jié)果表明，篩選的最佳提取條件基本穩(wěn)定，有較好的重復(fù)性。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析Table.2 Results and analysis of orthogonal test

3.結(jié)論

本文通過復(fù)合酶法優(yōu)化提取黃芪多糖工藝，以黃芪多糖含量為考察指標(biāo)，以酶解溫度、酶濃度、酶解時(shí)間及酶解pH為試驗(yàn)因素，得到最佳酶解提取工藝條件為：酶解溫度50℃，酶濃度5.5%，酶解時(shí)間3.5h，酶解pH6.0。在此提取工藝條件下，黃芪多糖含量占原藥材的8.58%。利用優(yōu)化后的復(fù)合酶法工藝進(jìn)行黃芪多糖提取，具有操作不僅簡便、快速，而且重復(fù)性、穩(wěn)定性良好等優(yōu)點(diǎn)，適用于黃芪多糖的規(guī)模化提取，為黃芪多糖的進(jìn)一步深入研究提供依據(jù)。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].2015年版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2015.

[2]國家食品藥品監(jiān)督管理局藥師資格認(rèn)證中心組織.中藥學(xué)專業(yè)知識(shí).二[M].中國醫(yī)藥科技出版社,2017.

[3]陳國輝,黃文鳳.黃芪的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國新藥雜志,2008,17(17):1482-1485.

[4]徐旭，湯立達(dá).黃芪的心血管藥理作用研究進(jìn)展[J].中國新藥雜志,2003,12（11）：899-901.

[5]范文彤.黃芪多糖對(duì)小鼠免疫功能的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥,2018(3).

[6]李海歐,陳琪,林英華,等.正交設(shè)計(jì)優(yōu)化黃芪多糖提取工藝[J].畜牧與飼料科學(xué),2018,39(01):1-3.

[7]扎羅,劉振東,王波,等.復(fù)合酶法提取西藏金耳粗多糖工藝研究[J].輕工科技,2018(1).

[8]薛燕,敢小雙,黃開麗,等.鐵皮石斛多糖復(fù)合酶法提取工藝及其抗氧化性[J].食品工業(yè)科技,2018,39(03):215-219+225.

[9]張宇,馬永強(qiáng),劉曉飛,等.發(fā)芽糙米中多糖提取工藝優(yōu)化及抗氧化研究[J].食品研究與開發(fā),2018(1):30-37.