吸入用丹參總酚酸藥物微粉的制備及其質量評價＊

黎翊君，戴俊東，王漸鴻，余家齊，王 杰，茅玉煒

（北京中醫藥大學中藥學院 北京 102488）

目前，已有大量文獻報道丹參水溶性成分丹參總酚酸除了對多種心血管疾病具有治療作用外，丹參總酚酸還能通過抗氧化應激損傷、抑制血小板聚集和抗炎癥損傷等途徑，對急性肺損傷、慢性阻塞性肺疾病等肺部疾病發揮著治療和保護作用[1-5]。目前有關丹參總酚酸的研究多采用口服或注射的給藥方式，體內研究表明丹參總酚酸口服生物利用度低[6]；而靜脈滴注雖能使藥物直接進入血液循環而直接發揮治療作用，治療效果較好。但對于一些慢性肺部疾病，其需長期用藥，導致患者依從性較差。肺部吸入給藥作為一種非注射途徑的給藥方式，患者依從性較好。同時可靶向遞送藥物至肺部，降低給藥劑量和毒副反應。加上肺部較大的吸收表面和豐富的血管分布，藥物在肺部能快速地被吸收而直接進入血液循環，可避免肝臟首過效應，提高生物利用度，在預防和治療呼吸系統疾病方面優勢顯著[7]。

行星式球磨機多用于藥物的微粉化及混合，可實現微米甚至納米級別的超微粉碎[8]，其具有藥物用量少，產率高、成本低、操作簡便等優勢，在科研研究中應用廣泛。課題組前期實驗表明采用共研磨法制備丹酚酸-丹參酮微粉的球磨工藝對藥物的結晶態影響較小[9]，但是經過微粉化的藥物粒子具有較高的表面自由能，粒子間靜電吸附作用明顯，易產生粒子團聚的現象。卵磷脂是一種生物相容性好、易吸收的機體內源性物質，用其包合水溶性藥物粒子，對粒子表面進行修飾，可改善由于靜電吸附和藥物吸濕性造成的粒子團聚現象。精氨酸是《中國藥典》2015年版（二部）收載的常用氨基酸類藥，L-精氨酸為人體內源性堿性氨基酸，在一些市售的凍干粉針和注射劑中，L-精氨酸常用作穩定劑和pH調節劑[10]，作為“分散性增強劑”用于降低粉末的表面自由能[11]，同時對肺部炎癥具有一定的干預和保護作用[12]。

本實驗擬沿用課題組前期篩選出的球磨制備工藝[9]，濕法球磨制備得到丹參總酚酸藥物微粉并對其進行粉體學性質評價，對比卵磷脂的加入及加入比例、精氨酸的加入對丹參總酚酸藥物微粉粉體學性質的影響，篩選出粉體學性質較優的藥物微粉，為后續干粉吸入劑的制備提供物質基礎。

1 材料與方法

1.1 試藥和儀器

丹參總酚酸原料（南通飛宇生物科技有限公司，總酚酸含量80%，丹酚酸B含量不低于60%）；L-精氨酸（北京酷來搏科技有限公司，純度≥98%），卵磷脂（上海麥克林生化科技有限公司，純度＞90%），硫酸銨，無水CaCl2，正庚烷均為分析純。

變頻行星式球磨機（XQM-0.4 L，南京大冉科技有限公司）；不銹鋼球磨罐（100 mL，南京大冉科技有限公司）；冷凍干燥機（LGJ-12，北京松源華興科技發展有限公司）；SUPRA 55場發射掃描電鏡；激光粒度分布儀(BT-2001，丹東百特儀器有限公司)；真空干燥箱(DZF-6050，上海博迅實業有限公司)；LC-20A高效液相色譜系統（SPD-20A檢測器，日本島津公司）；Kromasil C18色譜柱（4.6×250 mm,5 μm，北京迪馬科技有限公司）；CPA225D電子分析天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；Twister（蘇州萬通定量閥系統有限公司）；新一代藥用撞擊器(Copley Scientific公司)。

1.2 丹參總酚酸微粉的制備

取丹參總酚酸原料100 g，加水溶解過濾后得到丹參總酚酸溶液，用50 mg?mL-1L-精氨酸調節pH為5.0左右，分別凍干得到丹酚酸（不調pH值）、丹酚酸-精氨酸2種凍干粉。每種凍干粉分別加入0.5%、1%和2%的卵磷脂，沿用課題組前期制備工藝，選擇正庚烷為分散劑，漿料濃度為50%（g?g-1），研磨介質為Φ3和Φ5不銹鋼磨球（數量比8∶1），球料比17.5，研磨轉速為250 r?min-1，球磨3.5 h后將球磨罐內的漿料直接轉移至扁形稱量瓶中，30℃減壓干燥24 h后，從扁形稱量瓶中轉移出藥物過150目篩，即得6種藥物微粉分別為丹酚酸-0.5%卵磷脂（Sal-0.5%）、丹酚酸-1%卵磷脂（Sal-1%）、丹酚酸-2%卵磷脂（Sal-2%）、丹酚酸-精氨酸-0.5%卵磷脂（Sal-Arg-0.5%）、丹酚酸-精氨酸-1%卵磷脂（Sal-Arg-1%）、丹酚酸-精氨酸-2%卵磷脂（Sal-Arg-2%）。

1.3 丹參總酚酸微粉的質量評價

1.3.1 微觀形態

采用SUPRA55場發射掃描電鏡對粉末的表觀形態和聚集狀態進行觀察，分別取少量Sal原料、2種凍干粉和6種藥物微粉均勻分布于導電膠布上，離子濺射儀上噴金30 min后，于掃描電子顯微鏡上觀察，并采集圖像。

1.3.2 粒徑及其分布

采用丹東百特BT-2001激光粒度分布儀干法模式下測定Sal原料和6種藥物微粉的粒徑及其分布，分散介質為空氣，樣品為通用，氣體壓力范圍為0.15-0.25 Mpa。

1.3.3 流動性

采用固定漏斗法測定Sal原料和6種藥物微粉的休止角，每個樣品平行測定3次。

1.3.4 引濕性

取一干燥器里面放置硫酸銨過飽和溶液，將干燥的扁形稱量瓶置于干燥器中，24 h后精密稱定重量。取Sal原料和藥物微粉置于真空干燥箱（內置無水Ca-Cl2）中25℃脫濕24 h，平衡初始水分。取已平衡水分的Sal原料和藥物微粉約0.5 g，平鋪于扁形稱量瓶中，精密稱定重量，再置于上述干燥器中，分別于10 h和30 h后取出，蓋好蓋子，精密稱定重量，計算Sal原料和6種藥物微粉的吸濕増重，平行測定3次。

1.3.5 丹參總酚酸藥物微粉體外沉積性質的測定

1.3.5.1 HPLC色譜條件與系統適應性

擬沿用前期實驗已建立的丹酚酸B HPLC含量測定方法，色譜柱為Kromasil C18（5 μm，250×4.6 mm）；流動相為乙腈-0.4%磷酸溶液（26∶74）；流速1.0 mL?min-1，檢測波長286 nm，柱溫30℃，進樣量10 μL。理論板數按丹酚酸B峰計算應不低于6 000。

1.3.5.2 體外沉積率的測定

采用新一代藥用撞擊器（NGI）分別測定Sal-1%、Sal-2%、Sal-Arg-1%和Sal-Arg-2%4種丹參總酚酸藥物微粉的體外沉積率，通常在20℃且相對濕度低于35%的條件下模擬藥物微粉在肺部的沉積狀況。首先打開NGI的鉸鏈蓋，按序將預分離器(pre-separator)、人工喉（induction port）和合適的入口適配器（mouthpiece adapter）同NGI上端入口處依次連接，S1-S7級收集杯內預涂硅油層預防粒子回彈。取裝有藥物微粉的3號HPMC膠囊一粒（14 mg）置于Twister給藥裝置內，轉動旋鈕碰開膠囊殼，在60 L?min-1的抽氣流下抽吸4 s，檢查P3/P2≤0.5，重復此過程完成10粒膠囊。用甲醇-水（8∶2）分別清洗給藥裝置、人工喉、預分離器、S1-S7級收集杯及微孔收集器（MOC）中的含藥粉末，分別置于50 mL的棕色容量瓶中，甲醇-水（8∶2）稀釋至刻度，搖勻，HPLC分別測定6種丹參總酚酸藥物微粉各部分收集液中丹酚酸B的含量。

以歐洲藥典為參考，在流速為60 L?min-1時，S1-S7級各收集盤中粒子的截斷直徑分別8.06、4.46、2.82、1.66、0.94、0.55和0.34 μm。本實驗中定義10粒膠囊含藥量的平均值為總藥量（Total dose，TD），入口適配器、人工喉、預分離器、S1-S7級收集杯及MOC中的藥量之和為藥物微粉的遞送劑量（delivered dose，DD），S2-S7級收集杯及MOC中的藥量之和為微細粒子劑量（fine particle dose，FPD），即為空氣動力學直徑小于4.46 μm有效部位沉積量。計算4種丹參總酚酸藥物微粉的DD、FPD和微細粒子百分比（fine particle percent，FPP），利用MMAD calculator計算質量中間空氣動力學粒徑(mass median aerodynamic diameter，MMAD)和幾何標準差(geometric standard deviation，GSD)。通常認為，GSD大小越接近1，藥物微粉的粒度分布越窄。

2 結果與分析

2.1 微觀形態

微觀形態結果如圖1-圖9所示，由圖可知，Sal原料和2種凍干粉成不規則片狀，粒徑較大，粒徑跨度大；球磨后的藥物微粉粒徑明顯減小，但一些細微粒子間仍存在輕微的聚集現象；加入1%和2%卵磷脂的微粉其粒徑均勻性優于加入0.5%卵磷脂的微粉，粒子間的聚集現象也得到一定改善。

2.2 粒徑及其分布

圖1 Sal原料掃描電鏡圖

圖2 Sal凍干粉掃描電鏡圖

圖3 Sal-Arg凍干粉掃描電鏡圖

圖4 Sal-0.5%微粉掃描電鏡圖

圖5 Sal-1%微粉掃描電鏡圖

圖6 Sal-2%微粉掃描電鏡圖

圖7 Sal-Arg-0.5%微粉掃描電鏡圖

圖8 Sal-Arg-1%微粉掃描電鏡圖

圖9 Sal-Arg-2%微粉掃描電鏡圖

表1 粒徑測定結果

粒徑結果如表1所示，粒徑分布如圖10所示。根據《中國藥典》2015版四部制劑通則-0111吸入制劑項的規定：吸入制劑中原料藥物粒度大小通常應控制在10 μm以下，其中大多數應在5 μm以下。結果Sal原料粒徑較大，粒徑跨度范圍大，10 μm以下粒子百分比僅有56.92%，不符合藥典要求。球磨后的6種藥物微粉的粒徑均呈單峰分布，粒徑均小于10 μm，符合藥典要求，且5 μm以下粒子百分比均在85%以上。其中，Sal-Arg-1%、Sal-Arg-2%微粉粒徑均小于5 μm，其粒徑均小于Sal-1%、Sal-2%和Sal-Arg-0.5%微粉的粒徑，說明精氨酸和卵磷脂的加入能有效改善丹參總酚酸藥物微粉的粒徑及其分布。

圖10 Sal原料和6種藥物微粉粒徑分布圖

表2 Sal原料和6種藥物微粉的休止角（n=3）

2.3 流動性

Sal原料和6種藥物微粉的休止角結果見表2。采用SAS統計學軟件就卵磷脂的加入量對微粉流動性的影響進行單因素方差分析和多重比較，結果不同卵磷脂的加入量下藥物微粉的休止角不全相等，差異具有統計學意義（p≤0.0001），且SNK-q檢驗結果表明Sal原料組（不加卵磷脂）、0.5%卵磷脂加入量組與1%卵磷脂加入量組間具有統計學差異，而1%卵磷脂加入量組與2%卵磷脂加入量組間無統計學差異，結果加入1%和2%卵磷脂的微粉組流動性最好，其次是加入0.5%卵磷脂的微粉組，原料藥組的流動性最差，表明卵磷脂的加入可改善藥物微粉的流動性。

2.4 引濕性

結果見表3。①采用SAS統計學軟件就卵磷脂的加入量對10 h和30 h后微粉吸濕增重百分率的影響進行單因素方差分析和多重比較。結果10 h和30 h后不同卵磷脂加入量下藥物微粉的吸濕增重不全相等，差異均具有統計學意義（p≤0.0001）。SNK-q檢驗結果在10 h和30 h后，Sal原料組（不加卵磷脂）、0.5%卵磷脂加入量組與1%、2%卵磷脂加入量組間均具有統計學差異，增重百分率大小均為Sal原料＞0.5%卵磷脂加入量組＞1%卵磷脂加入量組＞2%卵磷脂加入量組。②采用SAS統計學軟件就精氨酸的加入對10 h和30 h后微粉吸濕增重百分率的影響進行單因素方差分析和多重比較。結果10 h和30 h后精氨酸組和不加精氨酸組藥物微粉的吸濕增重不全相等，差異均具有統計學意義（p≤0.0001）。SNK-q檢驗結果在10 h和30 h后，精氨酸組和不加精氨酸微粉組間均具有統計學差異，增重百分率大小均為不加精氨酸組＞精氨酸組。③結果表明卵磷脂和精氨酸的加入均可改善藥物微粉本身的吸濕性，且卵磷脂加入比例越大，相同條件下藥物微粉的吸濕增重越小。其中，以Sal-Arg-2%藥物微粉吸濕增重百分率最低。6種藥物微粉吸濕增重百分率均較大，可能是球磨后藥物粒子的粒徑減小，粒子比表面積增大，吸濕性較強，故在制劑的制備和貯存過程中應嚴格控制環境濕度。

表3 Sal原料和6種藥物微粉10 h和30 h后的増重百分率（n=3）

表4 4種丹參總酚酸藥物微粉中丹酚酸B的體外沉積性質測定結果

圖12 4種丹參總酚酸藥物微粉中丹酚酸B在NGI各層級的沉積率

根據上述微觀形態、粒徑及其分布、流動性和引濕性結果，發現卵磷脂的加入量對藥物微粉的粉體學性質影響較大，篩選出Sal-1%、Sal-2%、Sal-Arg-1%和Sal-Arg-2%4種丹參總酚酸藥物微粉進行體外沉積性測定。

2.5 丹參總酚酸藥物微粉體外沉積性質的測定

2.5.1 丹酚酸B的標準曲線

結果表面該方法專屬性、儀器精密度、方法重復性和加樣回收率均符合要求，丹酚酸B在0.0014-1.782 mg·mL-1范圍內與其峰面積呈良好的線性關系，標準曲線見圖11。

2.5.2 體外沉積率的測定

Sal-1%、Sal-2%、Sal-Arg-1%和Sal-Arg-2%4種丹參總酚酸藥物微粉中丹酚酸B的體外沉積性質測定結果如表4所示，丹酚酸B在NGI各層級的沉積情況如圖12所示。其中：①以Sal-Arg-2%的遞送率和微細粒子百分比最高，分別為72.99%和14.07%，其遞送率、微細粒子百分比、MMAD結果均優于Sal-Arg-1%，說明通過提高加入生理接受性良好的卵磷脂可一定程度上改善微粉的體外沉積性。②《中國藥典》2015版通則0951規定：除另有規定外，微細藥物粒子百分比應不少于每吸主藥含量標示量的10%。其中只有Sal-Arg-1%、Sal-Arg-2%（13.74%和14.07%）符合藥典規定，說明精氨酸對微粉的體外沉積性質具有改善作用。

3 討論

結合上述質量評價結果，精氨酸和卵磷脂的加入對丹參總酚酸藥物微粉粉體學性質具有一定的改善作用，且卵磷脂加入比例越大，粉體學性質越好，2%卵磷脂的加入量可以滿足藥典規定及生產要求。本實驗篩選出Sal-Arg-2%藥物微粉粉體學性質最好，其粒徑小于5 μm，D50為1.153 μm，休止角為25.66°±1.24，在10 h和30 h后的吸濕增重為別為7.42%±0.05和11.02%±0.04，遞送率為72.99%，微細粒子百分比為14.07%，MMAD為4.57 μm。故選擇Sal-Arg-2%藥物微粉為后續干粉吸入劑的制備提供物質基礎。

正常大鼠離體肺組織勻漿的pH約為7.30-7.56[13]。但是正常情況下，由于肺部pH值受到血液pH值和CO2氣體交換的影響，支氣管和肺泡粘液的酸性大于血漿。本實驗選擇L-精氨酸調節丹參總酚酸pH值為5.0左右，是考慮到丹參總酚酸酸性較強，20 mg·mL-1的丹參總酚酸原料水溶液測得其pH值為2.4左右。國家食品藥品監督管理局指出臨床注射丹參多酚酸鹽的pH值范圍應為4-6。丹酚酸B水溶液穩定性較差，而粉末的穩定性良好[14]，丹參總酚酸的指標性成分丹酚酸B穩定的pH值范圍為4-5，故兼顧安全性和丹酚酸B的穩定性，選擇調節丹參總酚酸溶液pH值為5.0左右，用于制備適合肺部吸入的藥物微粉。

由于經球磨后的藥物粒子成不規則的多面體，粒子間具有較大的表面能，再加上藥物本身具有較強的吸濕性，微粒間的靜電吸附現象明顯。NGI測定中，由于藥物與膠囊殼、給藥裝置間的靜電作用，大量藥粉粘附在膠囊殼和吸入裝置內壁上，難以隨著氣流進入撞擊器；而微粒間的靜電吸附使得小顆粒團聚導致粒徑增大，多數團聚體在人工喉和預分離器部位發生沉降，造成藥物在預分離器中的沉積率增大。靜電吸附現象影響了4種微粉的遞送率、微細粒子百分比FPP和GSD等結果，雖然卵磷脂的加入一定程度上能改善粒子間的團聚現象，但后期仍需加入載體改善粒子的流動性。

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