不同臟腑虛損對(duì)慢性阻塞性肺疾病患者病情及線粒體功能的影響＊

張少華，徐 丹，閆雪嬌，金 晶，荊 晶，姜 敏，李 爭(zhēng)，高 振，李風(fēng)森,5＊＊

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 烏魯木齊 830000；2.新疆國(guó)家中醫(yī)臨床研究基地COPD研究室 烏魯木齊 830000；3.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科 烏魯木齊 830000；4.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院呼吸病理生理實(shí)驗(yàn)室 烏魯木齊 830000；5.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院呼吸科 烏魯木齊 830000）

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是一種常見(jiàn)的、可以預(yù)防和治療的疾病，以持續(xù)呼吸道癥狀和氣流受限為特征，通常是由于明顯暴露于有害氣體與顆粒引起的氣道和/或肺泡異常所導(dǎo)致的[1]。線粒體普遍存在于真核細(xì)胞（成熟紅細(xì)胞除外），是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的主要場(chǎng)所，細(xì)胞生命活動(dòng)所需的能量大約95%來(lái)自線粒體，被喻為人體的“能量工廠”。研究[2，3]證實(shí)COPD患者存在線粒體功能障礙，有大量外文文獻(xiàn)[4]認(rèn)為線粒體參與了氣道重塑促進(jìn)了COPD的發(fā)生。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多認(rèn)為，COPD是氣道或肺組織暴露于有害氣體環(huán)境而致病，近年來(lái)也逐漸認(rèn)識(shí)到宿主因素在發(fā)病中的重要作用。中醫(yī)理論認(rèn)為臟腑虛損在COPD的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用，正虛積損為COPD的主要病機(jī)[5]。本文通過(guò)橫斷面調(diào)查的方法探討臟腑虛損對(duì)COPD病情的影響，發(fā)現(xiàn)隨著臟腑虛損程度越來(lái)越重COPD病情也越來(lái)越重，具有肺脾腎三臟虛損特征的COPD病情表現(xiàn)最重；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同臟腑虛損COPD患者外周血有核細(xì)胞線粒體功能，發(fā)現(xiàn)具有脾虛特征的COPD患者存在線粒體功能障礙，推測(cè)補(bǔ)脾療法可能改善線粒體功能障礙。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下：

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2016年1月至2017年10月在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院呼吸科門(mén)診就診的穩(wěn)定期COPD患者共161名。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)

①志愿受試者，依從性好；②年齡40-80歲；③符合西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)的COPD穩(wěn)定期患者；④符合中醫(yī)臟腑虛損標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

①COPD急性加重期患者；②合并支氣管哮喘、支氣管擴(kuò)張、氣胸、間質(zhì)性肺病、胸腔積液、肺癌、活動(dòng)性肺結(jié)核等其他嚴(yán)重肺部疾病的患者；③合并有嚴(yán)重心腦血管、肝腎和造血系統(tǒng)等原發(fā)性疾病患者；④精神病患者；⑤妊娠或哺乳期婦女；⑥合并腫瘤患者；⑦先天或后天性免疫缺陷者；⑧近1個(gè)月內(nèi)參加過(guò)其它臨床試驗(yàn)的患者。

1.1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)

（1）COPD的診斷

參照“GLOBAL INITIATIVE FOR CHRONIC OBSTRUCTIVE LUNG DISEASE 2016版”[1]制定。根據(jù)臨床表現(xiàn)、危險(xiǎn)因素接觸史、體征及實(shí)驗(yàn)室檢查等資料綜合分析確定。考慮COPD的主要癥狀為慢性咳嗽、咳痰和（或）呼吸困難及危險(xiǎn)因素接觸史；存在不完全可逆性氣流受限是診斷COPD的必備條件。肺功能測(cè)定指標(biāo)是診斷COPD的金標(biāo)準(zhǔn)。用支氣管舒張劑后FEV1/FVC＜70%可確定為不完全可逆性氣流受限。凡具有吸煙史及(或)環(huán)境職業(yè)污染接觸史及（或）咳嗽、咳痰或呼吸困難者均應(yīng)進(jìn)行肺功能檢查。COPD早期輕度氣流受限時(shí)可有或無(wú)臨床癥狀。胸部X線檢查有助于確定肺過(guò)度充氣的程度。

（2）COPD穩(wěn)定期的診斷（參照GOLD2016修訂版）

患者咳嗽、咳痰、氣短等癥狀穩(wěn)定或癥狀輕微。一般來(lái)說(shuō)，患者持續(xù)4-6周癥狀穩(wěn)定，未出現(xiàn)急性加重，即為穩(wěn)定期。

（3）臟腑虛損診斷標(biāo)準(zhǔn)

依據(jù)中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)制定的《中醫(yī)內(nèi)科常見(jiàn)病診療指南-中醫(yī)病證部分（2008版）》肺脹（ZYYXH/T4-49-2008）[6]和《慢性阻塞性肺疾病中醫(yī)診療指南（2011版）》[7]制定：

肺氣虛：①咳嗽和喘息、氣短，動(dòng)則加重；②神疲、乏力或自汗；③惡風(fēng)，易感冒；④舌質(zhì)淡、苔白，脈沉細(xì)或細(xì)弱。具備①和②、③、④中的2項(xiàng)即可診斷。

脾氣虛：①不欲食，納呆或食少；②胃脘脹滿(mǎn)或食后脹甚或便溏；③神疲乏力，少氣懶言，自汗，動(dòng)則加重；④舌體胖大或有齒痕，舌苔薄白或膩，脈沉細(xì)活沉緩或細(xì)弱。具備①和②中的1項(xiàng)，加中③、④的1項(xiàng)。

腎氣（陽(yáng)）虛：①腰膝酸軟，神疲乏力；②男子滑精早泄，女子月經(jīng)淋漓不盡；③耳鳴，頭昏或面目虛浮；④小便頻數(shù)清長(zhǎng)，夜尿多，或咳而遺尿；⑤舌質(zhì)淡，舌苔白，脈沉細(xì)或細(xì)弱。具備①、②中的1項(xiàng)加③、④、⑤中的1項(xiàng)。

一般來(lái)說(shuō)，同時(shí)具備肺氣虛和脾氣虛者為肺脾氣虛，同時(shí)具備肺氣虛和腎氣（陽(yáng)）虛者為肺腎氣虛，同時(shí)具備肺氣虛、脾氣虛和腎氣（陽(yáng)）虛者為肺脾腎虛。

1.2 患者信息采集

記錄患者人口學(xué)信息及病史資料，采用COPD評(píng)估測(cè)試量表（CAT）[8]、呼吸困難量表（mMRC）[9]對(duì)患者進(jìn)行評(píng)分、進(jìn)行六分鐘步行試驗(yàn)（6MWT）[10]。

1.3 線粒體實(shí)驗(yàn)

采集外周靜脈血約2 mL，紅細(xì)胞裂解液（武漢博士德公司，批號(hào)：12F29C18）處理抗凝全血，裂解液工作濃度為細(xì)胞濕體積的3-5倍，置冰上操作約5-10 min至紅細(xì)胞裂解完全，期間需搖動(dòng)混懸均勻，700 g 4℃離心棄上清提取有核細(xì)胞。PBS洗滌細(xì)胞沉淀1-2次制作細(xì)胞懸液，JC-1（美國(guó)sigma公司，批號(hào)：MKBX5979V）、DCFH-DA（南京建成公司，批號(hào)：20170331）染色，JC-1存儲(chǔ)液濃度為1 mg·mL-1（JC-1 1 mg，溶于二甲基亞砜1 mL），DCFH-DA存儲(chǔ)液濃度為10 mmol·L-1。具體染色方法：1 μL JC-1存儲(chǔ)液加入500 μL細(xì)胞懸液中；DCFH-DA 工作濃度為 10 μmol·L-1，1 μL DCFH-DA存儲(chǔ)液加入PBS1 mL制作工作液，取約500 μL工作液加入適量細(xì)胞沉淀重懸，37℃孵育30 min上流式細(xì)胞儀（Guava easyCyte 8HT，Merck Millipore公司）檢測(cè)，細(xì)胞懸液濃度不超過(guò)500 cells/μL，guavaSoft 2.7分析流式數(shù)據(jù)。

1.4 質(zhì)量控制

中醫(yī)辨證結(jié)論不能取得一致時(shí)雙人再次核對(duì)并由中級(jí)職稱(chēng)以上中醫(yī)師把關(guān)。肺通氣功能檢查采用日本產(chǎn)Chest HI-101型，測(cè)試質(zhì)量控制達(dá)到A、B級(jí)。（參閱中華醫(yī)學(xué)會(huì)肺功能指南2014版）[11]。

表1 不同臟腑虛損COPD患者性別比較（卡方檢驗(yàn)）

表2 不同臟腑虛損COPD患者mMRC比較（秩和檢驗(yàn)）

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPASS21.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)、計(jì)量資料符合正態(tài)分布方差齊采用單因素方差分析；相關(guān)性分析采用Pearson，不符合條件用非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 患者一般資料

按照中醫(yī)臟腑虛損標(biāo)準(zhǔn)，161例患者辨證為肺氣虛者36例、肺脾氣虛31例、肺腎氣虛50例、肺脾腎虛44例。患者年齡分布：肺脾腎虛組＞肺腎氣虛組＞肺脾氣虛組＞肺氣虛組，組間差異無(wú)顯著性（P=0.101），但兩兩比較肺氣虛組與肺脾腎虛組差異有顯著性（P=0.014）；性別分布經(jīng)卡方檢驗(yàn)各組間差異不具有顯著性（P=0.198），男女比率約為2∶1；身高在肺脾氣虛組表現(xiàn)最低，另外3組差異不明顯，4組間差異不具顯著性（P=0.429）；體重在肺脾氣虛組、肺脾腎虛組明顯減少，但4組間差異經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)不具顯著性（P=0.384）；病程在肺脾氣虛組最長(zhǎng)，肺氣虛組最短，4組間差異不具顯著性（P=0.503）。不同臟腑虛損COPD患者基線數(shù)據(jù)組間差異可參閱統(tǒng)計(jì)表1、表2。

2.2 不同臟腑虛損COPD患者病情比較

COPD患者mMRC經(jīng)秩和檢驗(yàn)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。肺功能FVC%在肺脾氣虛組最低，在肺氣虛組最高，但4組間差異不具有顯著性（P=0.265）；FEV1%在各組間差異具有顯著性（P=0.025，兩兩比較P值見(jiàn)表2.2）；CAT在各組間差異具有顯著性（P=0.001，兩兩比較P值見(jiàn)表2.2），6MWD在4組間差異不具顯著性（P=0.057），但肺氣虛組與肺脾、肺脾腎虛組比較差異具有顯著性（P＜0.05）；FEV1%、FVC%、6MWT均值在肺脾腎虛組最低，CAT均值在肺脾腎虛組最高（表3）。

2.3 不同臟腑虛損COPD患者外周血有核細(xì)胞線粒體功能比較

104例患者完成了線粒體實(shí)驗(yàn)，線粒體膜電位采用紅、綠熒光細(xì)胞百分比，細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）取平均熒光強(qiáng)度MFI進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。肺脾氣虛組線粒體膜電位與肺氣虛組、肺腎氣虛組比較差異有顯著性（P＜0.05）；肺脾氣虛組細(xì)胞內(nèi)活性氧與肺氣虛組、肺腎氣虛組比較差異有顯著性（P＜0.01）；肺氣虛組與肺腎氣虛組線粒體膜電位、細(xì)胞內(nèi)活性氧無(wú)明顯差異。膜電位在肺脾氣虛組明顯降低，活性氧在肺脾氣虛組明顯升高；線粒體膜電位與活性氧存在相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)0.223，P=0.021）。Pearson相關(guān)性分析顯示膜電位與活性氧相關(guān)系數(shù)0.223，P=0.021（表4）。

2.4 基線數(shù)據(jù)及各觀察指標(biāo)統(tǒng)計(jì)圖

從圖1可以看出，臟腑虛損對(duì)病情的影響由單一肺氣虛，發(fā)展為肺脾、肺腎兩虛，進(jìn)而三臟俱虛，F(xiàn)VC%、FEV1%、6MWT越來(lái)越低，CAT越來(lái)越高。線粒體膜電位在肺脾氣虛組最低，細(xì)胞內(nèi)活性氧在肺脾氣虛組最高。

3 總結(jié)與討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為COPD主要危險(xiǎn)因素是吸煙，空氣污染和生物燃料暴露也參與了該病的發(fā)生，除了環(huán)境暴露宿主因素也是COPD發(fā)生的另外一個(gè)重要因素[1]。中醫(yī)理論認(rèn)為，邪之所奏，其氣必虛。正氣存內(nèi)，邪不可干，病焉從來(lái)？人體自身抗病能力降低，不能抵御外邪才致疾病纏綿不愈[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著臟腑虛損程度越來(lái)越重，COPD的病情也越來(lái)越重。COPD臟腑虛損由單一肺氣虛，發(fā)展為肺脾、肺腎兩虛，進(jìn)而三臟俱虛。本研究結(jié)果顯示，肺脾、肺腎兩臟虛損相比較，肺脾氣虛證在FVC%、6MWD、CAT評(píng)分比肺腎氣虛更重且病程在肺脾氣虛組最長(zhǎng)，說(shuō)明肺脾氣虛較之肺腎氣虛病勢(shì)更為纏綿。雖然，肺脾氣虛證COPD纏綿難愈，但是，肺脾腎三臟虛損病情更為焦灼。研究數(shù)據(jù)顯示，COPD的病情總體表現(xiàn)在肺脾腎三臟虛損患者是最重的。FEV1%在客觀上反應(yīng)了COPD患者的氣道阻塞程度，CAT則在主觀上反應(yīng)了患者的病情，顯示了逐級(jí)演變的過(guò)程。COPD病之標(biāo)在肺，病之本在脾更在腎。腎為先天之本，脾為后天之本。腎藏元陰元陽(yáng)，腎陽(yáng)不足不能溫煦脾陽(yáng)，脾陽(yáng)不足則痰濁內(nèi)生，阻塞肺竅。腎陰不足，虛火上炎灼傷肺絡(luò)。內(nèi)經(jīng)云：女子五七陽(yáng)明脈衰，面始焦，發(fā)始?jí)嫞荒凶游灏四I氣衰，發(fā)墜齒稿。COPD發(fā)病多在40歲以后，這與內(nèi)經(jīng)描述的人腎氣衰退的時(shí)間節(jié)點(diǎn)是吻合的。本研究發(fā)現(xiàn)，具有腎虛特征的COPD患者占比58.38%，也說(shuō)明了腎虛在COPD發(fā)病中的重要作用。

表3 不同臟腑虛損COPD患者FEV1%、FVC%、CAT、6MWD比較(xˉ±s)

圖1 各證型線粒體膜電位和細(xì)胞內(nèi)活性氧平均熒光強(qiáng)度

線粒體呼吸鏈在利用氧產(chǎn)生ATP的同時(shí)也產(chǎn)生了大量的活性氧（ROS），導(dǎo)致線粒體DNA的損傷，Carpagnano等[13]發(fā)現(xiàn)MtDNA/nDNA的比率在COPD患者中顯著高于正常對(duì)照組。線粒體DNA損傷后可引起呼吸鏈有關(guān)蛋白質(zhì)亞單位合成障礙，形成有缺陷的呼吸鏈。線粒體跨膜電位則是一種反映細(xì)胞受損效應(yīng)較靈敏的指標(biāo)，受到損傷后膜電位就會(huì)降低［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，在肺脾氣虛組患者外周血有核細(xì)胞活性氧明顯升高、膜電位明顯降低，也證實(shí)了部分COPD患者存在明顯線粒體功能障礙。通常線粒體跨膜電位和ATP水平的升高表明線粒體功能增強(qiáng)，能量供應(yīng)充足，動(dòng)能增加，細(xì)胞、組織運(yùn)動(dòng)能力加強(qiáng)［15］。鑒于線粒體與運(yùn)動(dòng)的相關(guān)性，劉友章［16］從骨骼肌活動(dòng)基本形式探討了“脾主肌肉”的病理生理機(jī)制，認(rèn)為中醫(yī)脾的功能與線粒體的功能非常近似，從某種程度上說(shuō)線粒體就是“脾”的重要組成部分，脾主肌肉亦是通過(guò)線粒體的功能來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)VC%、6MWD在肺脾氣虛組明顯下降，可能與呼吸肌、骨骼肌線粒體功能障礙，ATP供給不足有關(guān)。綜合本研究各組數(shù)據(jù)來(lái)分析，可以看出肺脾氣虛組患者是最有特點(diǎn)的一類(lèi)，似乎脾虛對(duì)COPD病情的貢獻(xiàn)度最大。本研究發(fā)現(xiàn)具有脾虛特征的COPD患者存在線粒體功能障礙，推測(cè)補(bǔ)脾療法可能改善線粒體功能障礙，為COPD患者線粒體功能障礙的治療提供了方向。

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