基于UPLC-TQ MS的丹七軟膠囊中8種活性成分的溶出度考察

龐 穎，楊 健，高 峰＊

（1.中國中醫科學院西苑醫院 北京 100091;2.中國中醫科學院中藥研究所 北京 100700）

丹七軟膠囊功效為，活血化瘀，通脈止痛。用于瘀血閉阻所致的血瘀證和胸痹，癥見胸部刺痛、痛處固定、眩暈頭痛、經期腹痛[1-5]。主要由丹參、三七提取物組成。丹參的主要活性成分為酚酸類及丹參酮類物質；而三七的主要活性成分為三七皂苷。中藥具有多組分作用于多靶點實現中藥整體作用的特點，不同性質的活性成分溶出可能不具有同步性[6-8]。

液相色譜-質譜聯用作為一種高效互補的分離鑒定技術，具有靈敏度高、結果準確等特點因而得到廣泛應用。三重四極桿質譜儀的多反應監測模式（Multiple reaction monitoring，MRM）可以對選定的特異離子對進行質譜信號的采集，通過兩級離子選擇，排除大量干擾離子，使質譜的化學背景降低，大大的提高了定量分析中的靈敏度、重現性與準確度[9,10]。本文采用快速、高靈敏度、高選擇性的UPLC-TQ MS技術，同時考察丹七軟膠囊中的8種不同類型化合物的溶出規律。

1 材料與方法

1.1 儀器

超高效液相色譜儀（UPLC，美國Waters公司）；串聯API 5500三重四極桿質譜儀（美國Applied Biosystems公司），配備Waters UPLC自動進樣器，柱溫箱，數據采集由Analyst軟件完成。RCZ-8B溶出試驗儀（天津市天大天發科技有限公司）。

1.2 試藥

丹酚酸 B（111562-200202，純度97%），迷迭香酸（111871-201505，純度98%），丹參素（110855-200902，純度98%），三七皂苷R1（110745-200905，純度95%），人參皂苷Rb1（110704-200602，純度94%），人參皂苷Rg1（110703-200405，純度95.0%）對照品購自中國藥品生物制品檢定所；丹酚酸 A（SH-A0055，純度98.0%），鼠尾草酸（SH-1096746，純度98.0%）購自北京萬佳首化生物科技有限公司。

表1 UPLC-TQ MS參數優化表

丹七軟膠囊（美納達）（批號：15010110、15030113、15050112）由北京長城制藥廠生產，均購自金象大藥房（西單店）。

1.3 色譜條件

不同的目標化合物用不同的液相與質譜方法檢測：

丹參酚酸類化合物色譜條件（Meth1）：色譜柱：Waters Acquity HSS T3 column（100×2.1 mm,1.8 μm）；進樣量：1 μL；流速：0.6 mL·min-1；柱溫：30℃；流動相：A.水/甲酸（99.9∶0.1，V/V），B.乙腈（99.9∶0.1，V/V）；洗脫程序為：20-30%B(0-1.5 min)，30-90%B(1.5-2.0 min)，90%B(2.0-3.0 min)，90-20%B(3.0-3.5 min)，20%B(3.5-5.0 min)。

三七皂苷類化合物色譜條件（Meth2）：色譜柱：Waters Acquity HSS T3 column（100×2.1 mm,1.8 μm）；進樣量：1 μL；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：30℃；流動相：A.水/甲酸（99.9∶0.1，V/V），B.乙腈（99.9∶0.1，V/V）；洗脫程序為：10-60%B(0-7.0 min)，60-10%B(7.0-7.5 min),10%B(7.5-9.0 min)。

1.4 質譜條件

為了提高選擇性和特異性，采用MRM模式進行丹七軟膠囊中活性成分的分析。丹參酚酸類成分在Low Mass負離子模式下檢測；三七皂苷類成分在High Mass負離子模式下檢測。去簇電壓（DP），入口電壓（EP），碰撞能量（CE），碰撞室出口電壓（CXP）等重要參數都經過較好的優化并列于表1中。

1.5 溶出度的條件及測定

文獻[11]中優化了復方丹參片溶出度研究條件。復方丹參片中5種活性成分的溶出度比較,參照《中國藥典》2005年版二部溶出度測定法第二法進行溶出試驗。量取900 mL經脫氣處理的溶出介質（1%SDS水溶液），加熱使介質溫度升至并保持于（37±0.5）℃，取6粒丹七軟膠囊（批號：15010110），每個轉籃中投入1粒，共6個重復，轉速100 r·min-1進行試驗，于1、5、10、20、30、45、60、70、90 min定時、定點取樣2 mL，同時補加同溫等量的同種介質，樣品中加甲醇至4 mL，搖勻過0.22 μm PTFE濾膜，取續濾液，UPLC-TQ MS法進樣1 μL，測定目標化合物的含量，計算目標物的累積溶出度。

“文明素養”示范。采用推薦和尋訪相結合的方法，在全市范圍大力實施“萬千百”工程。展示“萬家文明風”。在全市各主要媒體開辟專欄，發掘、推出家庭文明新事，用凡人小事打動人，用身邊事引領身邊人，將發動的過程變為再教育的過程，以此帶動全社會風氣的不斷好轉。選樹“千人公德榜”。在新聞媒體、大型戶外媒體等設立“千人公德榜”，及時宣傳弘揚社會公德的典型，匯聚點滴“善小”，形成強大的道德正能量。上好“百堂道德課”。利用“萬家文明風”展示和“千人公德榜”設立的契機，廣泛收集身邊典型人物的典型事跡，使之成為全市道德教育的生動教材。

2 結果與分析

2.1 分析方法的建立與優化

為了更加準確快速的檢測丹七軟膠囊中的活性成分，分別針對不同性質的化合物建立了相應的UPLCTQ MS分析條件。丹七軟膠囊內容物樣品分析總離子流圖（圖1）中，丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、丹參素、鼠尾草酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1及人參皂苷Rg1在相對應的色譜分析條件下的出峰時間分別為1.28、1.61、1.77、0.84、2.89 min（Meth1）；3.22、4.40、4.81 min（Meth2）。兩種檢測方法的分析時間分別為5.0、9.0 min，各檢測目標化合物峰沒有雜質干擾，峰型較好，系統適用性實驗結果表明，儀器條件符合要求。

2.2 方法學確證

2.2.1 標準曲線的繪制

分別精密稱定丹酚酸A，丹酚酸B，迷迭香酸，丹參素，鼠尾草酸，三七皂苷R1，人參皂苷Rb1，人參皂苷Rg1，50%甲醇超聲波輔助溶解并放冷稀釋，制得上述對照品濃度分別為0.51、0.60、0.49、0.58、0.35、0.65、0.45、0.59 mg·mL-1貯備液。精密量取一系列體積的貯備液至10 mL量瓶中，加50%甲醇超聲輔助溶解并稀釋至刻度，得到各對照品系列標準溶液。在相應的UPLC-TQ MS分析方法下進樣1 μL，記錄色譜峰面積，以對照品濃度（c）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標做圖，制得各對照品標準曲線。

圖1 丹七軟膠囊中活性成分的UPLC-TQ MS分析

各目標化合物的標準曲線在相應的線性范圍內線性良好（r2＞0.9990）。丹酚酸A：Y=585745X+21103（r2=0.9997），丹酚酸 B：Y=1,286,559.81X+607,506.21（r2=0.9998），迷迭香酸：Y=135022X+6.5×107（r2=0.9996），丹參素：Y=232802X+18119（r2=0.9999），鼠尾草酸：Y=1.1×107X+3.5×106（r2=0.9993），三七皂苷R1：Y=6356.3X+21348（r2=0.9992），人參皂苷Rb1：Y=3925.2X+4537（r2=0.9991），人參皂苷Rg1：Y=3852.5X+54761（r2=0.9995）。

2.2.2 精密度實驗

2.2.3 加樣回收率實驗

精密稱取0.2 g已知含量的軟膠囊內容物，共9份，分成3組，分別精密加入高、中、低濃度的對照品溶液，計算加樣回收率。如表2顯示，丹酚酸A，丹酚酸B，迷迭香酸，丹參素，鼠尾草酸，三七皂苷R1，人參皂苷Rb1，人參皂苷Rg1的回收率分別為101.1、99.5、98.2、98.8、98.4，102.1、101.5、100.1%，RSD 分別為 0.71、0.78、0.66、0.82、0.81、0.91、0.62、0.76%，結果表明了方法的準確度良好。

2.2.4 穩定性實驗

取一定量已知含量的軟膠囊內容物，溶解于50%甲醇溶液中，分別在 0、2、4、8、10、12、24 h過0.22 μmPTFE濾膜后，相應的UPLC-TQ MS分析方法進樣1 μL，記錄色譜峰面積，穩定性由RSD表示。樣品制備24 h內，檢測丹酚酸A，丹酚酸B，迷迭香酸，丹參素，鼠尾草酸，三七皂苷R1，人參皂苷Rb1，人參皂苷Rg1 的 RSD 分別為 0.61、0.72、0.57、0.62、0.78、0.84、0.48、0.79%，表明方法在24 h內具有較好的穩定性。

表2 加樣回收率實驗結果

圖2 丹七軟膠囊累積溶出度曲線

2.2.5 重復性實驗

取同一批丹七軟膠囊，取出內容物，按文獻中方法分別制備丹七軟膠囊的水溶性及脂溶性供試品溶液各6份，測定峰面積，由RSD表示重復性。丹酚酸A，丹酚酸B，迷迭香酸，丹參素，鼠尾草酸，三七皂苷R1，人參皂苷Rb1，人參皂苷Rg1的RSD分別為0.18、0.45、0.38、0.72、0.59、0.79、0.66、0.56%。表明方法的重復性較好。

2.3 溶出度的測定

以時間為橫坐標，累積溶出度為縱坐標，繪制溶出曲線，結果如圖2所示。丹七軟膠囊中活性成分特別是水溶性活性成分溶出較快，30 min時丹參中的丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、丹參素、鼠尾草酸等酚酸類成分和三七中的三七皂苷類即可達到最大的溶出（90%以上），體外溶出較快。

以丹參素和人參皂苷Rg1為指標性成分，分別對丹七軟膠囊的溶出均一性和溶出重現性試驗進行的考察。取丹七軟膠囊（批號：15010110）6粒，按所建立的溶出度測定方法進行丹七軟膠囊溶出均一性試驗，溶出曲線見圖3。結果表明，丹七軟膠囊的溶出均一性良好；取3批丹七軟膠囊樣品（批號：15010110、15030113、15050112），按所建立的溶出度測定方法進行溶出重現性試驗。溶出曲線見圖4，結果表明3批丹七軟膠囊的溶出重復性良好。

3 討論

圖3 丹七軟膠囊溶出均一性考察

圖4 丹七軟膠囊溶出重復性考察

本文建立了基于UPLC-TQ MS的丹七軟膠囊中8種主要活性成分的溶出度的考察方法。包括5個丹酚酸類物質（丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、丹參素、鼠尾草酸），3個三七皂苷類（三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1），且方法的準確度、精密度、重復性和穩定性均符合檢測要求。本研究結果顯示丹七軟膠囊中活性成分特別是水溶性活性成分溶出較快，30 min時丹參中的酚酸類成分和三七中的三七皂苷類即可達到最大的溶出（90%以上）說明其體外溶出快，具有溶出均一性。

在一定程度上，體外溶出試驗能夠預測藥物在體內的溶出狀況，藥物溶出度的測定是證明體內藥物釋放的一種嚴謹而有效的實驗室檢測方法[12-14]。由于中藥復方制劑成分復雜、有效成分較多，因此對其的溶出度研究更為重要。

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