酶聯免疫吸附試驗法的自配陰性質控物的均勻性和穩定性評價

岑偉明，梁越媚，梁寶環，黃明蘭，黃媛萍，方鳳媚，隋洪

(東莞康華醫院，廣東 東莞 523080)

作為臨床診療工作的核心，檢驗結果的準確性對臨床醫生的診療效果起著至關重要的作用。想要獲得高質量的檢驗結果，必須使用安全方便、性能可靠的室內質控物[1]，最終才能夠有效確保檢驗結果正確可靠[2]。酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法的影響因素眾多[3]，常見的有標本狀態、實驗溫度濕度、孵育時間、顯色時間等等，為了保證檢驗結果的準確性，需要使用質控物進行室內質量控制進行監測和控制[4]。在醫院等級評審條款中規定血清學檢測時須同時進行已知滴度的血清陽性質控與陰性質控。而在ISO15189：2012質量體系中，針對定性試驗，明確規定必須選擇濃度值為臨界值2～4倍左右的弱陽性及濃度值為臨界值0.5倍左右的陰性質控物進行室內質控監測。弱陽性質控物已經有較成熟的第三方商業質控物，但陰性質控物由于要求嚴格，且不同廠家的試劑盒的臨界值濃度不一，需求的陰性質控物濃度也不一致，導致目前市面上暫無類似的質控物可供選擇。故在保證實驗結果的有效性的前提下，本室采用自行配制方案來配制乙肝表面抗原（HBsAg）、人免疫缺陷病毒抗體（HIV）、梅毒特異性抗體（TP）、丙肝病毒抗體（HCV）四個項目的陰性質控物，具體配制方法及評價方案如下：

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 材料 國產酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測HBsAg、HIV、TP、HCV 試劑盒，合共 4 種試劑盒，除HIV試劑盒為北京萬泰公司提供外，其余3種試劑均為英科新創公司提供。上述試劑盒及標準物質均按說明書要求保存，在有效期內使用。

1.1.2 檢測儀器 TECAN SUNRISE酶標儀、上海一恒電熱恒溫水箱、匯松全自動酶標洗板機PW-960。所有儀器均按ISO15189質量體系要求進行校準。

1.2 配制方案

1.2.1 血清基質的制備 收集正常人血清 (乙肝兩對半及HIV、HCV、TP均陰性且無溶血或脂血)500 ml，混勻后以 3500～4500r/min 離心 10min，去除殘留的纖維蛋白和血細胞成份，56℃加熱30min滅活后制得質控物血清基質。

1.2.2 稀釋度的確定 用上述血清對項目的檢測試劑盒內自帶的陽性對照品做5～320倍系列倍比稀釋，測定抗體的滴度和各稀釋度的質控物吸光度值，每稀釋度平行做3孔，取其平均值。HBsAg、Anti-HIV、Anti-TP、HCV-Ab 取樣本/臨界值 （S/CO）在0.3-0.7范圍的稀釋度作為外部質控血清的最終稀釋倍數。

1.2.3 配制及保存 根據確定的稀釋度用制備的血清基質稀釋各個項目陽性對照品至目標濃度的質控物。將質控血清用0.12mm濾膜過濾除菌，按每天試驗用量分裝、標記、封口，-70℃以下保存。

1.3 均勻性評價 根據CNAS-GL03文件中均勻性評價的單因子方差分析方案來設計評價方案：在配制好的質控物中隨機抽取m=10個樣品，每個樣品重復測定n=2次，測試總次數為N=20次，自由度 f1=m-1=9、f2=N-m=10，以 C1-1、C1-2、C2-1、C2-2、……C10-1、C10-2表示每個測試的S/CO值，按下列步驟進行統計分析：

1.3.1 每個樣品的2次測試的平均值X1=(C1-1+C1-2)/2、X2=(C2-1+C2-2)/2、……X10=(C10-1+C10-2)/2；

1.3.2 全部樣品測試的總平均值X均=(X1+X2+……+X10)/10；

1.3.3 樣品內平方和SS1=(X1-X均)2+(X2-X均)2+……+(X10-X均)2，樣品內均方 MS1=SS1/f1；

1.3.4 樣品間平方和SS2=(C1-1-X1)2+(C1-2-X1)2+(C2-1-X2)2+(C2-2-X2)2+……+(C10-1-X10)2+(C10-2-X10)2，樣品間均方MS2=SS2/f2；

1.3.5 統計量F=MS1/MS2；

1.3.6 在當前實驗條件下，F臨界值為自由度為(f1，f2)及給定顯著性水平α（通常α=0.05）的臨界值Fα（f1，f2）即 F0.05（9，10），查表結果為 3.02；

1.3.7 若F小于F0.05（9，10）則表明樣品內和樣品間無顯著性差異，樣品是均勻的。

1.4 穩定性評價 將制備的質控物樣品在-70℃冰箱分別保存1、2、3…12個月，每日每測定批次取一個樣品解凍后當天使用，每份樣品測定1孔，以月份為單位收集數據，求得每月的平均S/CO值，要求該值小于1.00，即結果需保持為陰性。

1.5 結果統計 所有的結果統計均通過EXCEL完成。

2 結果

2.1 稀釋度的測定結果 根據上述稀釋度用制備的血清基質稀釋各個項目陽性對照品至目標濃度的質控物，按每日用量分裝并于-70℃保存備用。見表1。

表1 各項目的稀釋測定結果

2.2 均勻性評價 評價結果見表2及表3。由結果可知四個項目的 F 值均小于 F0.05（9，10）值 3.02，表明其均勻性無顯著性差異。

2.3 穩定性評價 結果見表3，可知四個項目的在12個月中的S/CO月均值均小于1.00，說明穩定性可以接受。

3 討論

在臨床實驗室中，質控物是保證室內質量控制工作的重要物質基礎[5]。但是目前臨床實驗室免疫定性分析使用的質控物存在項目單一且價格昂貴、訂購不方便等缺點，很多醫院同仁為尋求解決方法，開始自配質控物。王開軍等[6]配制出糖化血紅蛋白的質控物，效果穩定可靠；董莉等[7]通過收集血清配制出穩定的化學發光法定量質控物，其穩定性，精密度等符合使用要求。定性項目方面，有多篇文獻報道通過制備定性項目室內質控物，可以對定性項目的室內質控起到監控作用，實用價值良好[8-11]。綜上所述，在當前商業質控品不足的情況下，要解決實驗室的質控控制全面監控問題，自配質控物可以起到很好的補充作用。室內質控物的性能包括：基質、穩定性、瓶間差、分析物水平及預處理的要求等，與室內質量控制運行有效性密切相關，CNAS-CL39《醫學實驗室質量和能力認可準則在臨床免疫學定性檢驗領域的應用說明》文件（下稱CNAS-CL39文件）對自配質控物的評價要求至少應包括均勻性及穩定性評價[12]。

表2 均勻性評價結果

表3 穩定性評價結果

對于自配陰性質控物的均勻性，本文參考了CNAS-GL03：2006《能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》（下稱CNAS-GL03文件）中的單因子方差分析方案來進行評價，結果顯示四個項目的陰性質控物的F值均小于規定的Fa（f1，f2）值，表明其樣品內和樣品間無顯著性差異，質控物是均勻的。

另一個評價質控物質量的關鍵指標是穩定性[13，14]。由于試劑批間差、板間差和操作誤差等不確定的因素存在，導致ELISA試驗的精密度較高，有研究指出，手工實驗操作下，樣本吸光度值越低，CV值就越大，當S/CO值處于0.92至1.51的范圍下，CV值可高達26%[15]。而本文四個項目為陰性質控物，由于其S/CO均值僅為0.4左右，在剔除失控數據后，統計年度累積CV值分別為HBsAg-45.23%、HCV-46.51%、HIV-50.01%、TP-48.53%。CNAS-GL03文件中的穩定性評價方案，要求其測試方法必須是“精密而靈敏的”，故此方案并不適合評價精密度較低的ELISA定性試驗，而目前國內暫無適用的評價免疫定性試驗自配室內質控物的穩定性的標準文件。ELISA定性試驗的報告方法僅有兩種，有反應性（陽性）或無反應性（陰性），在CNAS-CL39文件中，有規定定性試驗的質控判定規則可以采用肉眼判斷結果規則，即陰、陽性質控物的檢測結果分別為陰性和陽性即表明在控。故據此筆者認為針對手工操作的定性試驗，其質控物的穩定性評價也僅須符合上述規則即可。縱觀四個項目一年的質控數據，其S/CO平均值均小于1.00，表明在12個月期間，仍能保持陰性的結果，是穩定的。

綜上所述，HBsAg、HIV、TP、HCV 四個項目的陰性質控物的均勻性和穩定性均符合實驗室要求，可以應用于臨床實驗的質量控制當中，保證實驗室結果準確。

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