EV71感染HFMD患兒中的細(xì)胞、體液及免疫因子水平變化分析

郭衛(wèi)軍

(鶴煤總醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鶴壁 458000)

手足口病(Hand foot and mouth disease，HFMD)是臨床常見的一種傳染性疾病，是由腸道病毒誘發(fā)的急性傳染病，其中常見感染病原體為腸道病毒71型 （enterovirus 71，EV71）、 柯薩奇病毒A16型，常發(fā)生于5歲以下的嬰幼兒，以發(fā)熱與手、足、口等部位的皮疹潰瘍?yōu)橹饕R床表現(xiàn)[1]。EV71具有高度嗜神經(jīng)性，起病急、進(jìn)展快，患者臨床表現(xiàn)程度具有差異性，病情輕者只會出現(xiàn)皮疹，重癥患者常合并腦膜炎、肺水腫、心肌炎、呼吸循環(huán)衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥，對患者的生命安全造成嚴(yán)重影響。臨床發(fā)現(xiàn)[2]，手足口疾病的發(fā)病機(jī)制除了與病原體感染相關(guān)外，還與患者機(jī)體免疫機(jī)制存在密切聯(lián)系。本研究對我院收治的82例HFMD患兒與30例健康兒童檢測細(xì)胞免疫學(xué)指標(biāo)、體液免疫學(xué)指標(biāo)，并分析其在手足口疾病發(fā)展中的作用，為臨床免疫支持提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床治療提供基礎(chǔ)性資料。

1 研究對象及方法

1.1 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ⑴HFMD患兒的診斷及病情分級標(biāo)準(zhǔn)參考衛(wèi)生部2010年公布的《手足口病診治指南》中的標(biāo)準(zhǔn)[3]；⑵患兒常見臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、手足口部皮疹及潰瘍，重癥患兒可表現(xiàn)為肌痙攣、腦炎、肺水腫、心肺衰竭等；⑶本研究獲得患兒家長的知情同意。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ⑴患兒病情未經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室確診；⑵合并先心病、急慢性全身性感染性疾病的患兒；⑶具有免疫缺陷性疾病的患兒。

1.2 研究對象 選取本院2012年2月－2015年12月收治的82例HFMD患兒進(jìn)行研究，根據(jù)《手足口病診治指南》中的標(biāo)準(zhǔn)分為輕癥組61例、重癥組21例，另選30例健康兒童作為對照組。

輕癥組61例，男34例、女27例，年齡1～3歲，平均（2.0±0.5）歲。 重癥組 21 例，男 12 例、女 9例，年齡 1～3 歲，平均（1.8±0.6）歲。 對照組 30 例患者，男 16 例、女 14 例，年齡 1～3 歲，平均（2.1±0.6）歲。三組對象的年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測方法 對比三組的細(xì)胞免疫指標(biāo)：CD3+、CD4+、CD8+、自然殺傷細(xì)胞（NK）；對比三組的體液免疫指標(biāo)：免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白 G（IgG）、免疫球蛋白 M（IgM）、補(bǔ)體 C3、C4；細(xì)胞因子水平：白細(xì)胞介素－6（IL－6）、白細(xì)胞介素－10（IL－10）、腫瘤壞死因子 α（TNF－α）的差異。

所有患者確診后24h內(nèi)接受相關(guān)檢查，清晨八點(diǎn)空腹抽取3ml肘靜脈血，進(jìn)行10min離心后提取血清，置入－20℃保存待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)中雙抗體夾心法測定白細(xì)胞介素－6（IL－6）、白細(xì)胞介素－10（IL－10）、腫瘤壞死因子 α（TNF－α）等細(xì)胞因子；采用日立全自動(dòng)7080生化分析儀測定免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白 M（IgM）、補(bǔ)體 C3、C4 等體液免疫指標(biāo)水平；采用Facscalibur型流式細(xì)胞儀測定CD3+、CD4+、CD8+等細(xì)胞免疫指標(biāo)水平， 試劑盒均購自北京邦定生物醫(yī)學(xué)公司。

1.4 治療方法 輕癥者使用西瓜霜噴劑 （批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z45021599，生產(chǎn)企業(yè)：桂林三金藥業(yè)股份有限公司），1～2g/次，3 次/d。 重癥者在使用西瓜霜噴劑基礎(chǔ)上口服利巴韋林顆粒（批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H51023510，生產(chǎn)企業(yè)：四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司），10～15mg/kg/d。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 正態(tài)分布的計(jì)量指標(biāo)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行描述，三組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD－t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；統(tǒng)計(jì)軟件采用SAS9.1。

2 結(jié)果

2.1 三組細(xì)胞免疫水平比較 重癥組、輕癥組的CD3+、CD4+、NK 細(xì)胞比例均顯著的低于對照組（P＜0.05），CD8+細(xì)胞比例顯著的高于對照組（P＜0.05）；重癥組的CD3+、CD4+、NK細(xì)胞比例均顯著的低于輕癥組（P＜0.05），CD8+細(xì)胞比例顯著的高于輕癥組（P＜0.05）；（表 1）。

表1 組細(xì)胞免疫水平比較（±s）

表1 組細(xì)胞免疫水平比較（±s）

注：與對照組比較 *P＜0.05，與重癥組比較 #P＜0.05。

4.3±1.1*2.7±0.8*5.4±1.2 1 6.2 0 4＜0.0 0 1組別輕癥組重癥組對照組F值P值n 6 1 2 1 3 0 C D 3+（%） C D 4+（%） C D 8+（%） N K（%）5 7.2±7.4*#3 8.6±8.0*6 8.5±8.3 1 9.4 7 1＜0.0 0 1 2 7.4±5.3*#1 6.9±5.8*3 5.1±6.4 1 3.2 8 6 0.0 0 2 2 9.3±6.1*#3 4.0±5.3*2 5.2±5.7 8.9 6 1 0.0 2 8

2.2 體液免疫指標(biāo)比較 重癥組、輕癥組患兒與對照組的IgA水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；重癥組、輕癥組的IgG、IgM顯著的高于對照組（P＜0.05），C3、C4 均顯著的低于對照組（P＜0.05）；重癥組、 輕癥組的 IgA、IgG、IgM、C3、C4差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；（表 2）。

2.3 三組細(xì)胞因子比較 重癥組、輕癥組的IL－6、IL－10、TNF－α 顯著的高于對照組（P＜0.05）；重癥組IL－6、IL－10、TNF－α 顯著的高于輕癥組 （P＜0.05）；（表 3）。

表2 體液免疫指標(biāo)比較（±s）

注：與對照組比較 *P＜0.05

0.21±0.07*0.20±0.06*0.28±0.05 11.395 0.009組別輕癥組重癥組對照組F值P值n 61 21 30 IgA IgG IgM 0.54±0.32 0.51±0.29 0.56±0.33 2.187 0.417 11.42±3.09*11.05±2.88*8.31±1.95 9.146 0.022 1.51±0.28*1.43±0.25*0.91±0.21 6.275 0.046 C3 C4 0.94±0.11*0.89±0.13*1.09±0.14 7.309 0.039

表3 三組細(xì)胞因子比較（±s）

表3 三組細(xì)胞因子比較（±s）

注：與對照組比較 *P＜0.05，與重癥組比較 #P＜0.05。

8 3.5 7±2 6.5 9*#4 3 1.8 3±9 8.7 4*3 9.9 6±1 8.4 0 7 3.0 8＜0.0 0 1組別輕癥組重癥組對照組F值P值n 6 1 2 1 3 0 I L－6 I L－1 0 T N F－α 2 5.8 6±4.8 2*#6 2.4 0±9.3 5*1 5.8 9±3.1 7 2 7.8 5 4＜0.0 0 1 4 6.7 5±1 6.9 5*#1 7 1.5 0±5 2.4 1*2 3.8 0±1 1.4 4 4 9.3 6 1＜0.0 0 1

3 討論

手足口病（HFMD）是由多種腸道病毒誘發(fā)的常見兒童傳染病，5歲以下嬰幼兒為易感人群[4，5]。誘發(fā)手足口疾病的腸道病毒主要為腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型，其中EV71病毒的傳染性較強(qiáng)，隱性感染比例較大，傳播途徑較為復(fù)雜，傳播速度較快，成為手足口的重要致病菌[6，7]。EV71病毒具有顯著的嗜皮膚與嗜神經(jīng)特性，對患者造成的臨床病癥程度不一致，病情輕者會出現(xiàn)自限性手足口病或皰疹性咽峽炎，病情較重者則會損害中樞神經(jīng)、呼吸系統(tǒng)，誘發(fā)腦水腫、心肌炎、腦炎等臨床病癥，對患者的生命安全造成嚴(yán)重影響。EV71病毒導(dǎo)致手足口病的發(fā)病機(jī)制尚未明確，可能與患者免疫系統(tǒng)相關(guān)[8，9]。

先天性免疫是人類機(jī)體抗病毒感染的第一道防線，自然殺傷細(xì)胞（NK）作為關(guān)鍵細(xì)胞，在EV71手足口疾病中發(fā)揮重要作用。EV71感染后患者機(jī)體內(nèi)NK細(xì)胞不斷減少，會下調(diào)激活型受體NKG2D表達(dá)，上調(diào)抑制型受體CD94與NKG2A的表達(dá)以抑制NK細(xì)胞的活化，不能使其胞漿內(nèi)PE、GrB與GNLY等細(xì)胞毒顆粒分泌至胞外，不能對已感染EV71的細(xì)胞發(fā)揮有效殺傷作用[10，11]。CD3+、CD4+、CD8+是一類具有免疫調(diào)節(jié)作用的T細(xì)胞亞群，能夠通過細(xì)胞接觸機(jī)制或細(xì)胞因子抑制機(jī)制調(diào)控免疫反應(yīng)，發(fā)揮了T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，其中CD4+協(xié)調(diào)B淋巴細(xì)胞分化產(chǎn)生抗體，CD8+具有抑制抗體合成、分泌作用，兩者的協(xié)調(diào)維持了人類機(jī)體的正常免疫應(yīng)答[12，13]。本研究中，重癥組、輕癥組的CD3+、CD4+、NK細(xì)胞比例均顯著的低于對照組，CD8+細(xì)胞比例顯著的高于對照組 （P＜0.05）；重癥組的CD3+、CD4+、NK細(xì)胞比例均顯著的低于輕癥組，CD8+細(xì)胞比例顯著的高于輕癥組 （P＜0.05），這說明EV71感染所致手足口患者免疫系統(tǒng)紊亂，其免疫水平隨著病情的加重而不斷變化。

IgG是唯一通過胎盤的一種免疫球蛋白，在小兒出生6個(gè)月后因代謝分解而逐漸消失，直至學(xué)齡期機(jī)體內(nèi)的IgG成分接近于成人，IgG能夠針對蛋白質(zhì)多肽抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答，具有中和游離外毒素、病毒，能夠發(fā)揮吞噬細(xì)胞的作用，是下呼吸道的重要保護(hù)性抗體[14]。IgM是機(jī)體初次體液免疫反應(yīng)的重要免疫球蛋白，其半衰期為5d，在血液中的存在時(shí)間較短，機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)會導(dǎo)致其水平升高[15]。C3、C4作為補(bǔ)體系統(tǒng)中的重要分子，是衡量機(jī)體炎性的重要指標(biāo)，其水平變化與患者的炎癥反應(yīng)、機(jī)體免疫力具有密切聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)，重癥組、輕癥組患兒與對照組的IgA水平無差異性，重癥組、輕癥組的IgG、IgM顯著的高于對照組，C3、C4均顯著的低于對照組；重癥組、輕癥組的 IgA、IgG、IgM、C3、C4 相比無差異性， 這表明EV71感染所致的手足口病抗病毒抗體均屬于IgG、IgM，其水平降低會降低患者呼吸道黏膜的防御能力，無法阻止病毒入侵體液而加重病情。本研究還發(fā)現(xiàn)，重癥組、輕癥組的 IL－6、IL－10、TNF－α顯著的高于對照組；重癥組 IL－6、IL－10、TNF－α 顯著的高于輕癥組（P＜0.05），這提示 EV71 感染手足口病患者血清中 IL－6、IL－10、TNF－α 等炎癥因子隨著病情的加重，其水平不斷上升，由于IL－6、IL－10、TNF－α對中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、免疫功能細(xì)胞具有激活作用，過度表達(dá)會刺激患者局部炎癥反應(yīng)，加重病情。因此，臨床根據(jù)免疫學(xué)指標(biāo)的變化，針對性治療手足口患兒，輕癥者采用西瓜霜噴劑，清熱解毒、消腫止痛，利于消除口腔潰瘍。重癥者口服利巴韋林顆粒，該藥物屬于合成的核苷類抗病毒藥，是廣譜抗病毒藥物，進(jìn)入被病毒感染的細(xì)胞后會迅速磷酸化，損害病毒RNA合成，選擇性的抑制病毒復(fù)制，緩解臨床病癥。

綜上所述，EV71病毒感染HFMD患兒多存在顯著的免疫功能紊亂，表現(xiàn)為患兒的細(xì)胞免疫水平降低、體液免疫反應(yīng)增強(qiáng)。臨床治療時(shí)應(yīng)在緩解患者臨床病癥的同時(shí)改善其免疫水平，增強(qiáng)患者機(jī)體免疫力。但由于本研究的樣本量、隨訪時(shí)間有限，尚未對藥物治療的療效進(jìn)行分析，有待于進(jìn)一步深入探究。

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