尾加壓素I I受體拮抗劑對高肺血流性肺動脈高壓大鼠肺組織TGF-β1表達的影響

張松躍，任躍，何躍娥，李皓，吳蓉洲

（溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 兒童心臟中心 溫州醫科大學心臟發育與轉化醫學研究所，浙江 溫州 325027）

高肺血流所致肺動脈高壓（pulmonary arterialhypertension，PAH）是未經治療左向右分流型先天性心臟病患者的嚴重合并癥，最終會導致艾森門格綜合征，直接影響其手術時機、成功率及術后的長期生存質量。既往研究表明，尾加壓素 II（urotensin II，U II）在PAH的形成中起重要作用，但UII在PAH中的具體作用機制目前尚不明確[1-3]。本研究采用外科手術建立分流術模型，以模擬左向右分流型先天性心臟病所致PAH，應用U II受體拮抗劑帕洛舒侖（Palosuran）[4]，研究U II在PAH模型中的表達及其對轉化生長因子-β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）表達的影響，以探討高肺血流性PAH的病理生理過程及可能存在的機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

1.1.1 主要試劑：帕洛舒侖、DMEM高糖培養基、FBS（胎牛血清）均購自美國Hyclone公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、兔抗山羊IgG均購自美國Abcam公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、SDS、甘氨酸及Tris均購自上海國藥集團化學試劑有限公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；β-tubulin抗體、Tween20均購自美國Sigma-Aldrich公司；蛋白marker購自美國Thermo公司；抗U II多克隆抗體購自武漢博士德生物公司；DEPC購自上海生工生物工程有限公司；Dream Taq TM Green PCR Master Mix購自美國Thermo Fisher公司；Redzol、引物合成試劑盒購自上海賽百盛基因技術有限公司；U II標準品購自美國Sigma公司。

1.1.2 主要儀器：細胞培養超凈臺（蘇州蘇凈集團安泰公司），高速冷凍離心機（日本日立公司），蛋白電泳轉移系統（美國Bio-Rad公司），反轉錄儀（美國Thermo Fisher公司），PCR儀（美國Thermo Fisher公司），凝膠成像分析儀（法國Vilber Lourmat公司），熒光顯微鏡測定儀（德國萊卡公司），倒置相差顯微鏡（日本尼康公司），激光共聚焦掃描顯微鏡（德國卡爾蔡司公司）。

1.2 方法

1.2.1 高肺血流型PAH模型建立及分組：選取60只體質量100～120 g的雄性SD大鼠[購自上海斯萊克公司，動物許可證號：SCXX（滬）2007-0005]。按隨機數字表法分為3組，每組20只，分別為PAH組（S組）、假手術組（C組）及U II抑制組（M組）。S組和M組參照文獻[5]進行造模：頸部正中切口，逐層分離，游離右側頸總動脈和頸外靜脈，4-0縫線結扎大鼠頸總動脈遠心端，確認后，再取血管鉗阻斷其近心端，于遠心端結扎線以下0.5 cm處切斷頸總動脈，使頸總動脈固定于自制套管上，再將縫扎的動脈端插入頸外靜脈上，觀察發現靜脈充血，或見明顯靜脈搏動，表明血管通暢，造模成功。C組僅游離頸總動脈、頸外靜脈。M組大鼠造模后1周給予U II受體抑制劑帕洛舒侖灌胃，每次300 mg·kg-1，每日2次。其余組予等劑量0.9%氯化鈉溶液每日2次做對照。

1.2.2 右心室壓力測定：分別于造模后第4、第8、第12周，按隨機數字表法每組選取5只大鼠，采用45 mg·kg-1苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，采用右 心導管導引插管分別檢測右心室壓力（相當于肺動脈壓力）[6]，12周頸椎脫臼法處死后再留取心臟及肺組織標本。

1.2.3 Western blot法檢測肺組織中U II和TGF-β1蛋白的表達：凍存的肺組織細胞加5倍體積細胞裂解液后于超聲勻漿儀勻漿至無細胞結構，離心分裝，用SDS煮沸變性后上樣于聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，然后電轉移至硝酸纖維膜上，與非放射性物質標記的抗體特異性結合成像以檢測相關抗原的質與量，采用Quantity One凝膠軟件分析系統來分析上述蛋白光密度值。

1.2.4 RT-PCR檢測肺組織中TGF-β1 mRNA表達：取左下肺組織200 mg在液氮中研磨，一步法提取總RNA，后加入提前設計好的引物于PCR儀上進行RT擴增，擴增后產物mRNA再進行瓊脂糖凝膠電泳，與Marker比較檢測mRNA的含量，以β-tubulin為內參照。引物設計：檢索Genbank數據庫中β-tubulin、TGF-β1的mRNA序列，利用primer 5.0軟件設計引物，然后經過Blast匹對，由上海賽百盛基因技術工程有限公司合成。β-tubulin上游引物5’-TACAATGGCTCCTCCGAT CT-3’，下游引物5’-AGATCAACCAGGACGGCA-3’，產物長度96 bp；TGF-β1上游引物5’-CAAGCAGAACCCAGTCTAT GC-3’，下游引物5’-TGAGGGACTCTGGTCTTTGTG-3’，產物長度432 bp。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS17.0軟件進行統計分析。計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性檢驗采用Levene檢驗，兩兩比較方差齊性者采用LSD檢驗，方差不齊者采用Dunnett’sT3檢驗，U II及TGF-β1蛋白表達與肺動脈壓力值的相關性采用Pearson相關性分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠生存情況及右心室壓力比較 S組術后死亡4只大鼠（死于右心衰竭），M組術后死亡3只大鼠（死于右心衰竭），C組術后死亡1只大鼠（死因不明），死亡時間多在術后2～3周。造模后第4、第8、第12周，S組大鼠右心室壓力均顯著高于C組，M組顯著低于S組，M組顯著高于C組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3組大鼠右心室壓力值隨時間變化情況（n=5±s，mmHg）

表1 3組大鼠右心室壓力值隨時間變化情況（n=5±s，mmHg）

與C組比：aP＜0.05；與S組比：bP＜0.05；1 mmHg=0.133 kPa

組別 第4周 第8周 第12周C組 18.5±0.43 17.9±0.35 19.0±0.37 S組 25.3±1.53a 31.2±1.46a 37.4±1.32a M組 23.4±1.08ab 28.3±0.94ab 33.6±1.14ab

2.2 3組大鼠肺組織UI I和TGF-β1蛋白表達量比較 造模后第12周，S組大鼠肺組織中U II蛋白表達量較C組顯著升高，M組較S組顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。S組大鼠肺組織中TGF-β1蛋白表達量較C組顯著升高，M組較S組顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 3組大鼠肺組織中TGF-β1 mRNA表達量比較 造模后第12周，S組大鼠肺組織中TGF-β1 mRNA表達量較C組顯著升高，M組較S組顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

2.4 相關性分析 U II蛋白表達量與肺動脈壓力值、TGF-β1蛋白表達量及mRNA表達量均呈正相關（r=0.987、0.979、0.966，P＜0.05）。見圖4。

3 討論

圖1 3組大鼠U II蛋白表達量比較（n=5）

圖2 3組大鼠TGF-β1蛋白表達量比較（n=5）

高肺血流性PAH是左向右分流型先天性心臟病最常見的并發癥，對疾病發展和預后有決定作用。以往以PAH發生機制為中心，人們已經對多種體液、神經及局部因素于PAH的形成過程當中重建肺血管架構和舒縮功能效果進行了研究，但PAH病理過程十分復雜，至今尚未徹底闡明其發病機制[7-9]。

圖3 3組大鼠肺組織中TGF-β1 mRNA表達量比較（n=5）

U II是目前發現收縮血管活性最強的活性肽[10]。我們的前期研究中也發現，在先天性心臟病PAH患兒的肺組織中存在著U II的表達，并隨著肺動脈壓力的升高表達明顯增強[3]。PAH是指肺動脈平均壓＞30 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）者，本研究中使用外科手術建立分流模型[5]，以模擬左向右分流型先天性心臟病所致PAH。大鼠于造模后監測右心室壓力，至第12周，S組和M組大鼠右心室壓力均＞30 mmHg，提示PAH，表明模型建立成功。本研究發現相對于C組，S組中存在U II蛋白含量顯著升高，而在給予U II受體拮抗劑帕羅舒侖后，肺動脈壓力顯著降低，且經相關性分析，發現U II蛋白表達與肺動脈壓力呈正相關關系，因而我們推測，U II在高肺血流性PAH大鼠模型中表達增高，可能參與了PAH的發生發展。

研究表明，肺血管重構是PAH發生發展的重要環節。平滑肌細胞、成纖維細胞的異常增殖和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）沉積是肺血管重構的基礎[11-12]。而TGF-β是促進成纖維細胞表型轉化和膠原合成的重要活性因子。其中TGF-β1是目前研究較多的細胞因子，活性最強，廣泛表達于內皮細胞、上皮細胞和成纖維細胞等，參與調控細胞增殖、分化和ECM沉積。WANG等[13]報道，暴露在煙霧中的倉鼠發生PAH和肺血管重構過程中，TGF-β1蛋白顯著升高。利用TGF-β1抑制劑SD-208可明顯降低野百合堿誘導的大鼠PAH模型中肺動脈壓力和血管重構程度[14]。DAI等[15]在體外培養的心肌成纖維細胞中發現，TGF-β1抗體能抑制U II的促膠原合成作用，且U II能夠促進TGF-β1及其mRNA的表達，這表明U II可能通過TGF-β1發揮促心肌纖維化的作用。

圖4 大鼠肺組織中U II蛋白表達量與肺動脈壓力、TGF-β1蛋白表達量及mRNA表達量的相關性（n=10）

研究發現，PAH組大鼠肺組織中U II、TGF-β1蛋白及mRNA表達水平相對于假手術組有顯著升高，相關性分析顯示U II與TGF-β1蛋白和mRNA表達水平呈正相關，提示在高肺血流性PAH大鼠模型中，存在TGF-β1表達，U II能夠促進TGF-β1濃度增加，而在給予U II受體拮抗劑帕羅舒侖后，大鼠肺組織中U II、TGF-β1蛋白及mRNA表達水平顯著降低。推測其機制可能是帕羅舒侖抑制U II與其受體結合，使U II及TGF-β1表達水平降低，減輕血管收縮，抑制血管重構，從而緩解PAH的產生。

綜上所述，在PAH大鼠模型中存在U II高表達，給予U II受體拮抗劑帕羅舒侖可顯著抑制U II的表達，其機制可能是通過減少TGF-β1表達，而緩解大鼠高血 流性PAH形成和血管重建，但有待進一步研究闡明。

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