脂氧素A4通過p38 MAPK及Nrf2通路調(diào)控氣道炎癥反應(yīng)

卓樂盈，吳鎮(zhèn)杰，于祥，周美茜，李成業(yè)，歐陽(yáng)金生，林琪斌，蔡暢

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.永嘉縣中醫(yī)院 呼吸科，浙江 溫州 325105；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸科，浙江 溫州 325015）

氣道慢性炎癥是大多數(shù)呼吸道疾病的重要臨床病理生理特征。近年來(lái)，隨著環(huán)境污染的逐漸加重，氣道慢性炎癥性疾病的發(fā)生率逐年增長(zhǎng)。人體氣道與外界環(huán)境相通，直接接觸各種氧化劑和毒性物質(zhì)、吸入性過敏原、病原微生物以及空氣污染物等，均可通過不同的機(jī)制激發(fā)炎癥反應(yīng)。

脂氧素（lipoxins，LXs）是一種重要的內(nèi)源性脂質(zhì)抗炎介質(zhì)，能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)的及時(shí)消退，被譽(yù)為炎癥反應(yīng)的“剎車信號(hào)”或“停止信號(hào)”[1]。研究發(fā)現(xiàn)LXA4及其類似物在小鼠哮喘模型中具有抑制炎癥及促進(jìn)炎癥消退的作用，包括增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞功能，刺激巨噬細(xì)胞表達(dá)CD206[2]，還可以促進(jìn)肺損傷的修復(fù)[3]。但目前LXs在氣道炎癥進(jìn)程中參與的信號(hào)通路及其分子調(diào)控機(jī)制尚未完全清楚。本研究通過脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激BEAS-2B細(xì)胞，探討LXA4對(duì)氣道炎癥反應(yīng)的抑制作用及其所涉及的信號(hào)通路。

1 材料和方法

1.1 材料 BEAS-2B細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)。LPS、Trizol和DCFH-DA試劑購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；LXA4購(gòu)自美國(guó)Cayman Chemical公司；BEGM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Lonza公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；谷胱甘肽（Glutathione，GSH）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；BCA試劑盒、細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；人p38、p-p38抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signal Technology公司；人核因子E2相關(guān)因子（nuclear factor erythroidderived 2-like 2，Nrf2）、p-Nrf2、核纖層蛋白B1（Lamin B1）抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；人β-tubulin抗體購(gòu)自杭州聯(lián)科生物公司；SYBR Green realtime PCR Master Mix、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制：LPS配成貯存濃度為100μg/mL 的溶液，分裝后-20℃保存；為保持試劑穩(wěn)定性，LXA4用無(wú)菌無(wú)水乙醇溶解，配成貯存濃度為100 μmol/L 的溶液，分裝后-80℃保存?zhèn)溆茫褂脮r(shí)取適量溶液，待無(wú)水乙醇蒸發(fā)完畢后，加入培養(yǎng)基重新溶解。

1.2.2 BEAS-2B細(xì)胞培養(yǎng)：BEAS-2B細(xì)胞培養(yǎng)于BEGM培養(yǎng)基，按1×105個(gè)細(xì)胞/mL密度接種到培養(yǎng)瓶，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，BEAS-2B細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞匯集至70%～80%時(shí)，按1:3傳代。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)：將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的BEAS-2B細(xì)胞分為3組。對(duì)照組：不做任何處理；LPS組：100 ng/mL LPS刺激24h；LPS+LXA4組：100 nmol/L LXA4預(yù)處理30min，加入100 ng/mL LPS刺激24h。收集細(xì)胞或培養(yǎng)上清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：以Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，并測(cè)定RNA濃度及純度（2.0＞A260/A280＞1.8）。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。取cDNA產(chǎn)物用SYBR Green real-time PCR Master Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的基因表達(dá)倍數(shù)變化。IL-1β上游引物序列：5’-CCAGGAGAATGACCTGAGCA-3’，下游引物序列：5’-GGAGCGTGCAGTTCAGTGAT-3’；IL-6上游引物序列：5’-TGAGGAGACTTGCCTGGTGA-3’，下游引物序列：5’-TGCAGGAACTGGATCAGGAC-3’；血紅素加氧酶-1（heme oxygenase，HO-1）上游引物序列：5’-CAGTGCCACCAAGTTCAAGC-3’，下游引物序列：5’-CTGGATGTTGAGCAGGAACG-3’；醌氧化還原酶[NAD（P）H：quinone oxidoreductase，NQO-1]上游引物序列：5’-AAGCCGCAGACCTTGTGATA-3’，下游引物序列：5’-TGGCAGCGTAAGTGTAAGCA-3’。GAPDH直接從上海生工生物工程公司購(gòu)買。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)：收集各組細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液[細(xì)胞數(shù)量為（5～6）×106]，用PBS清洗2～3次，用0.4mL含1% FBS的PBS重懸細(xì)胞，分別加入流式管。各組加入DCFH-DA，37℃孵育20～30min。PBS清洗2～3次，加入0.3mL含1% FBS的PBS重懸細(xì)胞，注意避光。用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，F(xiàn)lowJo.10軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.6 GSH含量檢測(cè)：收集各組細(xì)胞[細(xì)胞數(shù)量為（5～6）×106]，用PBS作為勻漿介質(zhì)破碎后離心取上清，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GSH表達(dá)水平，測(cè)定方法根據(jù)南京建成生物工程研究所試劑盒說明書操作。各組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔以減少誤差。

1.2.7 Western blot：BCA法測(cè)定蛋白濃度。抗體濃度分別為：兔抗p38抗體、兔抗p-p38抗體、兔抗Lamin B1抗體、兔抗Nrf2抗體和兔抗p-Nrf2抗體 1:1 000；鼠抗β-tubulin抗體1:4 000，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體、羊抗鼠IgG抗體1:8 000。用Bio-Rad Image Lab軟件分析條帶光密度，半定量比值測(cè)定分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，用Shapiro-Wilk法行正態(tài)性檢驗(yàn)，用Levene法行方差齊性檢驗(yàn)，各組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法檢驗(yàn)，方差不齊采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LXA4對(duì)LPS誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和IL-1β的影響 與對(duì)照組比，LPS組BEAS-2B細(xì)胞IL-6和IL-1β mRNA水平明顯升高（P＜0.05）。與LPS組比，LXA4+LPS組BEAS-2B細(xì)胞IL-6和IL-1β mRNA水平顯著降低（P＜0.05），見圖1。

2.2 LXA4對(duì)LPS誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展常伴隨著大量氧自由基的產(chǎn)生。在LPS的刺激下，BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。LXA4預(yù)處理后，ROS水平明顯下降，而GSH水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

2.3 LXA4對(duì)LPS誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞p38 MAPK通路的影響 p38 MAPK通路在炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生過程中有著重要的作用。與對(duì)照組比，LPS可顯著上調(diào)p-p38/p38水平（P＜0.01），而LXA4能夠明顯抑制p-p38的蛋白表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。

2.4 LXA4對(duì)LPS誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞Nrf2通路的影響

在LPS的刺激下，BEAS-2B細(xì)胞核內(nèi)Nrf2表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01），胞漿Nrf2表達(dá)水平上升（P＜0.05），Nrf2磷酸化水平下降（P＜0.05）。而經(jīng)LXA4預(yù)處理后，核內(nèi)Nrf2表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），胞漿Nrf2水平明顯下降（P＜0.05），Nrf2磷酸化水平顯著上調(diào)（P＜0.01），見圖4。

圖1 各組BEAS-2B細(xì)胞IL-6和IL-1β mRNA水平的比較

2.5 LXA4對(duì)LPS誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞Nrf2下游分子表達(dá)的影響 與對(duì)照組比，LPS組HO-1 mRNA表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01），NQO-1 mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。LXA4預(yù)處理后，HO-1和NQO-1 mRNA水平出現(xiàn)顯著的上調(diào)（P＜0.01），見圖5。

3 討論

研究表明支氣管上皮細(xì)胞在氣道慢性炎癥以及氣管重塑的過程中發(fā)揮著重要作用。支氣管上皮細(xì)胞不僅僅是一層屏障，它可以通過模式識(shí)別受體（Toll-like receptor，TLR）識(shí)別環(huán)境中的刺激物，分泌上皮細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞因子，橋接固有免疫和適應(yīng)性免疫[4]。活化的支氣管上皮細(xì)胞可促進(jìn)Th2型細(xì)胞因子的釋放，募集并激活其他炎性細(xì)胞，發(fā)揮主動(dòng)調(diào)節(jié)作用，同時(shí)誘導(dǎo)上皮下纖維的沉積，促進(jìn)肺部慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，LXA4在哮喘發(fā)病過程中，可以促進(jìn)NK細(xì)胞所介導(dǎo)的粒細(xì)胞凋亡，并且可影響NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用[6]。本研究發(fā)現(xiàn)LXA4具有抑制支氣管上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)以及促進(jìn)炎癥消退的作用。在BEAS-2B細(xì)胞中，LXA4預(yù)處理顯著抑制了由LPS引起的促炎因子和ROS的產(chǎn)生，同時(shí)LXA4還誘導(dǎo)抗氧化酶和GSH的表達(dá)顯著上調(diào)，并且該作用在一定程度上依賴p38的磷酸化水平和Nrf2的核轉(zhuǎn)位及磷酸化水平。因此，LXA4在氣道炎癥性疾病中發(fā)揮抗炎和抗氧化作用，對(duì)肺部炎癥的預(yù)防和治療具有一定的作用。

圖2 各組BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)ROS和GSH水平的比較

圖3 各組BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)p-p38和p38表達(dá)水平的比較

在過敏性哮喘患者中，由氣道上皮細(xì)胞合成與釋放的IL-6可調(diào)節(jié)效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞的功能，誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞向Th2型細(xì)胞的分化，促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展，造成肺組織損傷[7-9]。IL-1β是肺部炎性級(jí)聯(lián) 反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，它可刺激細(xì)胞黏附分子的產(chǎn) 生，選擇性募集炎性細(xì)胞，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的表達(dá)[10]。因此，抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生是控制肺部炎癥發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要手段。本研究發(fā)現(xiàn)LXA4預(yù)處理可顯著抑制LPS誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞IL-1β和IL-6 mRNA的表達(dá)。這與以往在巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和人視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞中的研究[11-12]結(jié)果一致。

圖4 各組BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)Nrf2核轉(zhuǎn)位以及磷酸化水平的比較

另外，氣道上皮細(xì)胞也是直接接觸外部環(huán)境刺激，產(chǎn)生ROS引起氣道氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要細(xì)胞之一[13]。靜息狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)ROS的水平處于動(dòng)態(tài)平衡，并且維持在極低的水平。過量的ROS也能夠促進(jìn)炎癥因子以及其他炎癥相關(guān)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，及時(shí)清除ROS可有效抑制炎癥的發(fā)生發(fā)展。LPS可刺激巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞ROS的生成，本研究發(fā)現(xiàn)，LXA4能夠明顯抑制LPS誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)的ROS的產(chǎn)生。另外，GSH是重要的內(nèi)源性抗氧化劑，可直接清除自由基和ROS，保護(hù)過氧化誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。本研究發(fā)現(xiàn)LXA4顯著上調(diào)了LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞胞內(nèi)GSH的合成與表達(dá)。p38 MAPK通路是各種轉(zhuǎn)錄因子的上游信號(hào)調(diào)節(jié)器，如NF-κB、AP-1[14]，參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和細(xì)胞死亡等過程。有研究發(fā)現(xiàn)，在中性粒細(xì)胞中，LXA4可以降低AP-1與DNA的結(jié)合能力，抑制下游炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[15]。在氣道上皮細(xì)胞中，抑制p38 MAPK通路可抑制IL-6的合成與分 泌[16-18]。NF-κB通路的激活能夠上調(diào)IL-1β的分泌，后者又能夠進(jìn)一步促進(jìn)NF-κB通路的激活。LPS通過與TLR4結(jié)合可快速活化p38 MAPK途徑，本研究發(fā)現(xiàn)氣道上皮細(xì)胞在LPS的刺激下，p-p38表達(dá)增加，這與氣道炎癥條件下磷酸化的p38表達(dá)水平增高具有一致性，而LXA4可以抑制p38 MAPK途徑的激活。因此，LXA4可能通過調(diào)控p38 MAPK信號(hào)通路抑制促炎因子的表達(dá)。該作用與小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)一致，而在心肌細(xì)胞系H9c2中，LXA4上調(diào)了p-p38的表達(dá)水平[19-20]，造成這種差異的主要原因可能跟細(xì)胞類型有關(guān)。

圖5 各組BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)HO-1及NQO-1 mRNA水平的比較

研究發(fā)現(xiàn)，通過激活Nrf2通路能夠有效抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)引起的肺損傷[21]。Nrf2是人體普遍存在的一種抗氧化轉(zhuǎn)錄因子，在抑制LPS誘導(dǎo)的氧化損傷中發(fā)揮著重要的保護(hù)作用[22-23]。在正常狀態(tài)下，Nrf2主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，與細(xì)胞質(zhì)中肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白KEAP1相互結(jié)合，保持在一個(gè)低表達(dá)狀態(tài)，且易被泛素蛋白酶體途徑迅速降解。當(dāng)細(xì)胞受到氧化劑或毒性物質(zhì)的刺激時(shí)，KEAP1的分子構(gòu)象發(fā)生改變，Nrf2可從KEAP1上解離后活化，而活化后的Nrf2轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并與抗氧化反應(yīng)原件（antioxidant response element，ARE）的啟動(dòng)子部位結(jié)合，從而促進(jìn)一系列細(xì)胞保護(hù)基因和抗氧化酶的表達(dá)。Nrf2通路的激活是抗氧化應(yīng)激反應(yīng)有效的保護(hù)機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)的HO-1表達(dá)下降[24]。NQO-1和HO-1具有顯著的抗炎和抗氧化作用，兩者的表達(dá)受到Nrf2通路下游ARE的調(diào)控[25]。本研究發(fā)現(xiàn)LXA4能夠促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)位以及磷酸化，同時(shí)ARE下游基因NQO-1和HO-1的表達(dá)增高。因此，LXA4的抗氧化作用可能與Nrf2通路激活，使得抗氧化酶NQO-1和HO-1的表達(dá)水平升高有關(guān)。

綜上所述，LXA4可減輕LPS引起的BEAS-2B細(xì)胞炎癥反應(yīng)并促進(jìn)炎癥消退，其機(jī)制可能一方面與抑制p38 MAPK通路、減少促炎因子的分泌有關(guān)；另一方面與增強(qiáng)Nrf2的核轉(zhuǎn)位以及磷酸化、減輕氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

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