胚胎干細胞分泌因子增強AML-12細胞抗凋亡能力

林武，黃昭帥，鮑苗，陳肖鳴

（溫州醫科大學附屬第一醫院 小兒外科，浙江 溫州 325015）

得益于胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）的多向分化潛能，其為終末期肝臟疾病提供了可觀的潛在細胞移植供體。和體外培養的人原代肝細胞相比，誘導而來的“肝細胞樣細胞”的表型相對不成熟[1-6]，表現出與人體胚胎肝更相近的功能及表型特征[7]。然而即使是這樣不成熟的肝細胞卻也能很大程度地改善肝功能[8-9]。另外，在細胞移植中約只有10%的移植細胞存活[10-11]。近年來，ESC分泌因子的細胞保護作用逐漸被人們揭示，我們假設ESC移植治療肝臟損傷疾病的成功不僅是細胞移植本身的組織替代作用，其分泌的細胞因子也能夠幫助肝細胞抵抗凋亡，修復肝損傷。

1 材料和方法

1.1 材料 DMEM/F12、丙酮酸鈉、非必需氨基酸、 2-巰基乙醇、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、 0.25%胰酶EDTA購于美國Gibco公司；核酸混合物、白細胞抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）購于美國Millipore公司；胰島素轉鐵蛋白硒混合物（insulin-transferrin-selenium，ITS）、雙抗（100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素）購于美國Invitrogen公司；地塞米松、MTT試劑盒購于美國Sigma公司；CO2細胞培養箱購于美國Thermo公司；缺氧裝置購于加拿大Stemcell Technologies公司；Seahorse線粒體應激檢測試劑盒購于美國Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：ESC（F12）細胞系由美國羅格斯大學醫學院Melitta Schachner教授贈予；完全培養基為15% FBS、1%丙酮酸鈉、1%非必需氨基酸、1%核酸混合物、0.2% 2-巰基乙醇、1%雙抗、0.01% LIF；基礎培養基為高糖DMEM（含L-谷氨酰胺），培養ESC時需要每天加入0.01% LIF以維持ESC的未分化狀態。解凍ESC，接種到用絲裂霉素處理的鋪滿成纖維細胞滋養層的培養皿中，在傳過3～4代之后，成纖維細胞滋養層細胞基本去除干凈，ESC懸浮培養于其完全培養基中。本課題中以其完全培養基為對照培養基即CON-M；ESC每2～3 d傳1代，并收集上清液，此ESC上清液即為條件培養基即ESC-M。細胞于含5% CO2、37℃的細胞培養箱中培養。AML-12細胞系為一種鼠源性肝細胞系，從美國ATCC公司購入；AML-12細胞完全培養基（簡寫為CM）為10% FBS、1% ITS、40 ng/mL地塞米松、1%雙抗、88% DMEM/F12。

1.2.2 AML-12細胞的培養方法：常規細胞培養：AML-12細胞培養于CM中，并置于含5% CO2、21% O2、37℃的細胞培養箱中；缺氧環境培養：AML-12分別培養于CON-M和ESC-M中，并置于5% CO2、1% O2、 37℃的缺氧裝置中；室內環境培養：AML-12分別培養于CON-M和ESC-M中，并直接置于室內非細胞培養箱環境中（極低CO2濃度、21% O2、20℃）；無血清培養：分別用CON-M和ESC-M處理AML-12細胞48h后，胰酶消化并按照每孔6 000個細胞數目的濃度重懸2種不同處理的細胞在CM中并接種于96孔板中，待細胞在細胞培養箱過夜貼壁后，將細胞培養液換成去除血清的CM繼續培養。

1.2.3 MTT細胞活性測定：取接種于96孔板中的AML-12細胞，棄舊液，每孔加入100 μL含0.5 mg/mL MTT的CM培養基繼續培養3h，棄培養基，加入150 μL DMSO搖床搖晃溶解10min后，立即在酶標儀中測定570 nm處的OD值。每組做3次重復，并做3次獨立重復實驗。

1.2.4 Seahorse細胞代謝呼吸動態分析：根據Agilent的Seahorse線粒體應激檢測試劑盒說明書來操作，步驟如下：分別用CON-M和ESC-M培養AML-12細胞48h后，胰酶消化并按照每孔種6 000個細胞數目的濃度重懸2種不同處理的細胞在CM培養基中并接種于Seahorse XFp細胞板中，待細胞在培養箱中過夜貼壁后，將細胞培養基換成Seahorse XFp基礎培養基，并在37℃烘箱中作用1h，之后將培養板的蓋子換成事先在不同通道中加入相應呼吸鏈抑制劑的特殊蓋子并加載入Seahorse分析儀中，分析儀自動加藥并測量細胞的耗氧量以及細胞外酸化率。每組做3次重復，并做3次獨立重復實驗。

1.3 統計學處理方法 采用GraphPad Prism 6.0軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，運用獨立樣本t檢驗進行2組比較，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正常培養環境下AML-12細胞在3種培養基中的細胞活性比較 分別用ESC-M、CON-M和CM培養AML-12細胞，并置于含5% CO2、21% O2、37℃的細胞培養箱中，MTT法比較各實驗組細胞活性情況。結果顯示在正常培養環境下，AML-12細胞在3種培養基中細胞活性及生長情況差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 AML-12細胞在3種培養基中的細胞活性比較

2.2 極端培養環境中AML-12細胞在2種培養基中的細胞活性比較 分別用CON-M和ESC-M培養AML-12細胞，并分別置于缺氧環境和室內非細胞培養箱環境（極低CO2濃度、20℃）中，MTT法比較各實驗組細胞活性情況。結果顯示在缺氧環境中，AML-12細胞生長緩慢且在ESC-M中培養的AML-12細胞顯示出更強的增殖能力（見圖2A-C）。在室內非細胞培養箱環境中，AML-12細胞逐漸凋亡且在ESC-M中培養的AML-12細胞顯示出更持久的耐受能力（見圖2D-F）。

圖2 AML-12細胞在不同培養基中對極端環境的適應性比較

2.3 被ESC上清液處理之后AML-12細胞對無血清培養基的耐受性 分別用CON-M和ESC-M處理AML-12細胞48h后，MTT法比較不同處理組AML-12細胞在其無血清完全培養基中的細胞生長情況，結果顯示細胞逐漸凋亡且被ESC-M處理后的AML-12細胞表出現出更強的無血清培養耐受能力，見圖3。

圖3 被不同培養基處理之后AML-12細胞對無血清環境的耐受能力比較

2.4 被胚胎干細胞上清液處理之后AML-12細胞的糖酵解潛力和氧化呼吸潛力 Seahorse細胞代謝呼吸動態分析顯示，被CON-M和ESC-M處理之后的AML-12細胞，其基礎呼吸情況以及糖酵解情況類似。當用ATP合酶抑制劑寡霉素抑制氧化呼吸鏈ATP合成后，ESC-M組的AML-12細胞表現出更強的細胞糖酵解潛力；以解偶聯劑FCCP干預后，ESC-M組的AML-12細胞表現出更強的氧化呼吸能力及氧化呼吸潛力，見圖4。

3 討論

圖4 被不同培養基處理之后AML-12細胞代謝呼吸情況比較

研究表明對急性肝損傷小鼠進行間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植能夠減輕肝臟結構紊亂和肝細胞功能的下降程度，并且能夠促進肝臟的再生[12-13]。陳棉等[14]研究發現在體外缺氧條件下MSCs凋亡膜微?？纱龠M心臟成纖維細胞的增殖和膠原合成能力。陳志文等[15]研究發現MSCs移植增強了子宮切口的再生愈合，提高了切口局部的機械張力，有望降低再次妊娠時子宮破裂的風險。MSCs對急性肝損傷的治療作用的具體機制目前并不明確，其分泌的細胞因子可能是發揮作用的關鍵，已經有研究發現MSCs的上清液能夠改善肝臟損傷情況[16-18]。WOO等[19]單純給急性肝損傷小鼠注射由ESC分化而來的不成熟“肝細胞樣細胞”細胞分泌因子，發現在不進行細胞移植的情況下，肝臟也出現明顯的再生和修復，并且證明了細胞移植治療的成功不單單是移植的細胞取代了組織，還可能是由于移植細胞的分泌因子促進了組織的再生。MORIYA等[20]將未分化的ESC移植在已經用四氯化碳引起的肝纖維化的小鼠脾中，發現移植了ESC之后，小鼠肝臟的纖維化情況明顯好轉。這些研究都顯示出ESC的分泌因子在肝臟疾病治療中的應用價值。

本研究以鼠源性肝細胞系AML-12細胞來研究ESC上清液（即ESC-M培養基）對肝細胞在極端環境中抗凋亡能力的影響，研究發現ESC-M能夠增強AML-12細胞在缺氧環境中的適應性，增強其在血清剝奪以及室內非細胞培養環境中的耐受能力。同時用Seahorse細胞代謝分析儀對分別經過CON-M和ESCM處理后的AML-12細胞呼吸代謝情況進行分析，當用ATP合酶抑制劑寡霉素抑制氧化呼吸鏈ATP合成之后，細胞所需能量全部由糖酵解提供，而糖酵解的產能效率低下，為滿足細胞對能量的需求，糖酵解加快發生，此時以細胞外酸化率間接反應的細胞糖酵解能力為細胞最大糖酵解能力，結果顯示ESCM處理組的AML-12細胞表現出更強的細胞糖酵解潛力。解偶聯劑FCCP使得質子大量回流但不產生ATP，從而使得細胞大量耗氧，此時以細胞氧消耗率反應的細胞氧化呼吸能力為細胞最大氧化呼吸能力，同樣顯示ESC-M處理組的AML-12細胞表現出更強的細胞最大氧化呼吸能力以及氧化呼吸潛力。這與我們之前發現ESC-M中的AML-12細胞在缺氧、血清剝奪以及其他惡劣環境下具有更強適應性相吻合。

LOTFINIA等[12]研究發現血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在MSC上清液對急性肝損傷中肝細胞的修復具有重要作用，而WANG等[21]發現ESC-M與CON-M相比，VEGF含量顯著上升，這提示ESC-M中的VEGF或許是增強AML-12細胞抗凋亡能力的關鍵。然而SINGLA等[22]研究卻發現ESC-M中TIMP1是抑制H9c2細胞凋亡的關鍵。

本研究發現ESC上清液能夠增強AML-12細胞在極端環境中的抗凋亡能力。后續對其具體分泌因子的研究和機制的挖掘或許能夠給肝臟疾病以及其他與細胞凋亡相關疾病的治療提供新的思路，也可能對細胞的保存和運輸提供借鑒意義。

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