YAP1基因敲除對胰腺癌L3.6細胞增殖及遷移能力的影響

陳千杰，張金三，郭強，董晶萊，郭麗莎，李校堃

（溫州醫科大學 藥學院，浙江 溫州 325035）

胰腺癌是惡性腫瘤，患者5年生存率不足5%[1]。 其增殖、侵襲能力極強，往往在發病早期即發生轉移，是治療的難點[2-4]。Yes-關聯蛋白1（Yesassociate protein 1，YAP1）作為Hippo通路的關鍵轉錄輔助因子在胰腺癌的發生發展中有重要作用[5]，但相關機制仍不明了。YAP1具有調控細胞存活和增殖作用，參與癌細胞上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）[6]。EMT是腫瘤轉移的關鍵環節[7-8]。YAP1通過與轉錄因子結合參與胚胎發育進程[7，9-12]，在胚胎發育中起重要作用的因子，在癌變過程中往往被激活[13-14]。 當抑制KRAS后，會上調YAP1的表達，使YAP1直接參與腫瘤的形成[15-17]。本研究構建敲除YAP1基因的L3.6細胞，檢測YAP1對L3.6細胞的增殖及遷移能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 人胰腺癌細胞株L3.6購自美國模式培養物集存庫；pSpCas9（BB）-2A-Puro V2載體購自美國Addgene公司；DMEM培養液、胰蛋白酶、1%青鏈霉素、胎牛血清購于美國Gibco公司；RNA提取試劑購于美國Invitrogen公司；EndoFectinTMMax轉染試劑購自廣州復能基因有限公司；考馬斯亮藍購自上海碧云天生物公司；YAP（D8H1X）XP Rabbit抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，GAPDH 單克隆抗體購自英國Abcam公司；Western blot相關試劑、羊抗小鼠IgG二抗與羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物科技有限公司；正置、倒置熒光顯微鏡購自日本尼康公司；PCR儀、電泳儀、電泳槽、化學發光成像儀購自美國Bio-Rad公司，BD Accuri C6流式細胞儀購自美國BD公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度計購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；酶聯免疫檢測儀購自美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：L3.6細胞在含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養基中培養，常規置于37℃、5% CO2環境下生長。細胞融合至80%左右時常規傳代。

1.2.2YAP1敲除載體的構建：采用CRISPR-Cas9技術在L3.6細胞中敲除YAP1基因。首先針對YAP1基因的第1個外顯子序列，篩選出最佳的先導序列：5’-CATCAGATCGTGCACGTCCG-3’，并據此設計合成用于pSpCas9-KOYAP1構建的寡聚核苷酸序列：oligo1： 5’-CACCGCATCAGATCGTGCACGTCCG-3’，oligo2：5’-AAA CCGGACGTGCACGATCTGATGC-3’。經磷酸化修飾，并退火成雙鏈后，連接克隆到BbsI酶切和去磷酸化修飾的pSpCas9（BB）-2A-Puro V2載體。轉化到感受態的大腸桿菌DH5α后，挑單克隆提取質粒和測序分析，驗證得到正確克隆的質粒。

1.2.3 篩選YAP1敲除的L3.6穩定細胞株：用CRISPRCas9-YAP1質粒轉染L3.6細胞24h后，經過嘌呤霉素篩選48h，再采用有限稀釋法，將單細胞懸液按50、100和200個細胞/皿的密度接種于10 cm培養皿，培養14 d，讓腫瘤細胞生長成單克隆團，然后用克隆環定點消化各個克隆并接種至24孔板中，細胞生長至布滿24孔板底75%時收集細胞，擴大培養以后，裂解獲得細胞蛋白，應用Western blot法檢測L3.6細胞的YAP1蛋白表達以驗證YAP1敲除是否成功。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達：分別收集WT組細胞（L3.6野生型細胞）和YAP1-KO組細胞（已敲除內源YAP1基因的L3.6細胞），細胞裂解液4℃裂解，12 000r/min離心，提取各組細胞總蛋白，用Bradford法測量蛋白濃度。變性后的蛋白樣本進行10% SDS-PAGE凝膠電泳，用孔徑0.45 μm的PVDF膜進行轉膜，封閉后用YAP1（1:1 000）、GAPDH（1:5 000）抗體雜交。TBST洗膜3次/7min，再加入相應的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔（鼠）二抗（1:10 000）室溫搖床孵育1h，TBST洗3次后，ECL化學發光法顯影，凝膠成像系統曝光并分析結果。

1.2.5 MTT法檢測細胞增殖情況：分別取對數生長期的WT組及YAP1-KO組細胞，鋪到60 mm培養皿中，待細胞匯合到70%～80%后，胰酶消化，用培養基重懸細胞并計數，將稀釋好的細胞懸液以每孔2×103個細胞接種于96孔板，每組細胞做6個復孔。放置于37℃、5% CO2培養箱中分別培養1、2、3、4、5、6 d后，每孔加入10μL MTT溶液（5 mg/mL），在培養箱中繼續培養4h后，吸棄上清，加入150μL DMSO溶液，于490 nm波長時測各孔吸光度值并記錄結果。重復實驗3次，取均值。

1.2.6 EdU細胞標記和流式細胞儀檢測細胞周期：分別提前1 d將WT組及YAP1-KO組細胞以1×105個/mL濃度接種于培養皿中，以調整為細胞最優狀態，待細胞融合度達70%～80%時，用不含EDTA的胰蛋白酶消化分裝（操作過程要輕柔），離心，4%多聚甲醛固定20min后，2 mg/mL甘氨酸中和5min，0.5% Triton X-100滲透后，加500μL的1×Apollo?染色反應液，重懸細胞，避光室溫孵育10min后，1 500r/min 離心5min，棄染色反應液。0.5% Triton X-100滲透劑室溫清洗1～3次，PBS重懸，置于流式細胞儀中檢測，觀察增殖細胞的染色情況。

1.2.7 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力：提前用馬克筆在6孔板背后，每孔均勻畫3條等距離橫線，然后每孔鋪約7×105個細胞，待次日觀察細胞已長滿皿底，用10μL小槍頭比著直尺垂直于背后的橫線劃痕。PBS洗細胞3次，去除脫了漂浮的細胞，加入無血清培養基，放入37℃、5% CO2細胞培養箱。按第1、第2、第3天的同一時間點取出6孔板，置于顯微鏡下觀察同一位置細胞遷移變化，最后拍照記錄。重復本實驗3次，取均值。

1.2.8 Transwell實驗檢測細胞遷移能力：首先消化并收集各組細胞，離心，用無血清培養基重懸并計數，以200μL共1×105個/孔的細胞密度鋪至小室的上室。下室內加入500μL含20%胎牛血清的完全培養基，置于37℃、5% CO2細胞培養箱24h。培養結束后取出小室，用棉簽小心擦去微孔膜上層未穿過膜的細胞，將小室用PBS浸泡清洗3次/5min， 4%多聚甲醛固定35min，0.1%結晶紫對微孔膜下細胞染色25min，再用PBS浸泡清洗3次/5min，至膜上背景紫色基本消失，用倒置顯微鏡觀察微孔膜。每組設定3個復孔實驗，取均值。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS18.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，2組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRISPR-Cas9載體及YAP1敲除細胞株構建 如圖1所示，構建的pSpCas9-KOYAP1質粒經測序分析表明插入的序列及位點正確，目的基因YAP1的敲除載 體質粒構建成功。為獲得YAP1敲除的穩定細胞系，用上述CRISPR-Cas9質粒轉染人胰腺癌細胞系L3.6，篩選后產生的單克隆團（見圖2A），分離培養后，獲穩定細胞株。經Western blot驗證，相對于WT組，YAP1-KO組細胞中的YAP1蛋白表達完全缺失，說明成功獲得了YAP1敲除的L3.6穩定細胞株（見圖2B）。

2.2 檢測敲除YAP1前后細胞增殖能力的變化 為檢測YAP1基因敲除對細胞增殖的影響，采用MTT實驗構建細胞生長曲線。結果發現，相對于野生型的WT組細胞，YAP1-KO組細胞的增殖速度明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3A。進一步采用EdU細胞增殖實驗結合流式細胞儀觀察細胞周期分布，發現YAP1-KO組及WT組細胞的EdU陽性率，即處于S期的細胞數所占各自總細胞數的比例，分別為37.4%和54.7%，見圖3B。此結果表明Cas9敲除YAP1基因表達顯著抑制胰腺癌細胞L3.6的增殖能力。

圖1 用于YAP1基因敲除的質粒測序圖譜（下劃線為設計插入的先導序列）

圖2 YAP1基因敲除細胞株的構建

2.3 YAP1對胰腺癌細胞體外遷移能力的影響 為了觀察YAP1基因敲除對胰腺癌L3.6體外遷移的影響，采用劃痕實驗來比較細胞的遷移能力。結果發現，WT組在第1、第2、第3天的劃痕閉合進程日漸明顯，而YAP1-KO組劃痕幾乎沒有閉合，表明WT組細胞的遷移速度隨著時間的推進而增加，在第3天達到最大值，但是YAP1-KO組的遷移速度明顯下降，幾乎喪失遷移能力。2組細胞各時間段對應的遷移情況差異明顯（見圖4A）。進一步的Transwell實驗發現，在所有觀察的時間點，YAP1-KO組細胞轉移、穿透到下室的細胞數量與WT組比較均顯著降低（見圖4B）。

圖3 比較YAP1敲除前后L3.6細胞的增殖情況

3 討論

YAP1作為Hippo通路下游的主要效應蛋白之一，在腫瘤發生發展中的作用逐漸被認知。絕大部分的胰腺癌中存在KRAS突變，但研究發現抑制KRAS后，復發的胰腺癌中存在YAP1的過度激活，并且使胰腺癌細胞的侵襲轉移能力增強[16-17]。這提示過表達YAP1在胰腺癌復發、惡性化的過程中起重要作用，但是其機制仍不明確。盡管人們已經認識到YAP1參與部分腫瘤細胞增殖及轉移的進程，但是對胰腺癌細胞YAP1缺失后的增殖及轉移能力的具體變化還鮮有涉及。因此本研究利用CRISPR-Cas9技術構建YAP1敲除的穩定胰腺癌細胞系，通過一系列細胞生物學實驗，檢測敲除YAP1后對胰腺癌細胞增殖和轉移能力的影響。

圖4 YAP1敲除對L3.6細胞遷移能力的影響（×10）

CRISPR-Cas9技術是當下熱門的基因編輯技術。該技術可以方便、快捷地編輯細胞的基因組，在DNA水平調控目的蛋白的表達、突變[18-19]。在本研究 中，我們設計了針對YAP1的寡聚核苷酸的先導序列，基于pSpCas9（BB）-2A-Puro的載體，構建了CRISPRCas9-YAP1質粒。轉染L3.6細胞后，經過抗性篩選和單克隆化以后，成功獲得了敲除YAP1基因的L3.6細胞，標記為YAP1-KO細胞株。經驗證，其YAP1蛋白已經被完全敲除，且經多次傳代后，細胞性狀仍保持穩定，能進行下一步的增殖、遷移等生物學功能實驗。

細胞的惡性增殖與轉移在腫瘤的初發-惡性化過程中起著關鍵作用[20-21]，由于癌細胞增殖速度快，從腫瘤原發灶侵襲近端的正常組織并發生遷移到遠端臟器，甚至擴散到全身，因此癌細胞的增殖和遷移能力在腫瘤研究過程中至關重要[22-23]。本課題利用經Cas9技術敲除胰腺癌細胞中YAP1基因的模型，研究YAP1缺失對胰腺癌細胞增殖及遷移能力的影響，為此后進一步解析YAP1在胰腺癌發生發展中的作用及機制研究奠定基礎，結果表明YAP1缺失后，能顯著抑制胰腺癌L3.6細胞的增殖和遷移能力。EdU是胸腺嘧啶類似物，能在細胞增殖中代替胸腺嘧啶，嵌入復制中的DNA分子內，通過EdU與熒光染料的特異性結合，探測熒光信號，從而檢測細胞中DNA的復制活性，計算新增殖的細胞數量。MTT可以被細胞增殖過程中線粒體內的一些脫氫酶還原生成深紫色產物，當細胞增殖數越多，則在570 nm波長吸光度越高，因而被廣泛用于監測細胞增殖變化。本研究發現YAP1-KO組L3.6細胞的EdU陽性增殖率（即處于S期的細胞比例）和MTT吸光度（即細胞的相對活性）明顯低于WT組的L3.6細胞，表明敲除YAP1后，細胞周期受到阻滯，DNA復制活性、線粒體活性降低，表明YAP1敲除的胰腺癌細胞的增殖能力受到抑制。細胞劃痕法可以測定細胞的遷移能力，其借鑒體外細胞致傷愈合模型，在體外培養的單層細胞上，劃痕致傷，然后比較各組細胞間的遷移能力。Transwell是在上室接種細胞，下室加入FBS或特定趨化因子如FGF，細胞可能會穿透過聚碳酸酯膜向營養成分高的下室轉移，對下室的細胞染色，可直觀反映細胞的遷移情況。本研究結果顯示YAP1缺失的胰腺癌細胞，其劃痕愈合和穿透過膜等遷移能力受到極大地抑制。

綜上所述，在胰腺癌L3.6細胞敲除內源YAP1后，其增殖和轉移能力明顯減弱，這揭示YAP1有望成為治療胰腺癌的新靶標。

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