卡比多巴抑制肝癌HepG2細胞增殖及其作用機制

秦 舒，朱玉蓉

流行病學研究表明，帕金森病（PD）患者需長期服用左旋多巴和卡比多巴，其多種惡性腫瘤的發病率顯著低于正常健康人群，包括胃癌、肝癌、胰腺癌、直腸癌、前列腺癌、肺癌等，但黑色素瘤和乳腺癌除外[1]。由此推測，左旋多巴和卡比多巴是否可能具有抗癌作用。因此，針對左旋多巴進行了大量的研究，但實驗結果并未證實左旋多巴具有抑制多種惡性腫瘤的作用[2]。但研究發現，卡比多巴的化學結構與苯肼十分相似。苯肼是吲哚胺-2,3-雙加氧酶1（IDO1）的一種抑制劑，而IDO1則是細胞內色氨酸降解代謝的主要催化酶，其代謝產物犬尿氨酸又是芳香烴受體(AhR)的生理激活劑[3]。與此同時，大量相關實驗表明，AhR參與細胞增殖、凋亡及免疫代謝[4-6]，直接影響腫瘤的黏附、生長、遷移和侵襲。因此，不難提出假設，卡比多巴是否是通過影響AhR的活性來發揮抗癌作用。我國是乙肝大國，每年約有22萬人死于原發性肝癌，其死亡率在惡性腫瘤中排名第2[7]。本實驗建立肝癌HepG2細胞株的離體模型，通過不同濃度卡比多巴的干預，觀察HepG2細胞的增殖能力、AhR的激活以及CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1等靶基因轉錄水平的變化，借此驗證卡比多巴是否具有抗癌作用，并探索其可能的藥理機制，以期為肝癌的臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要細胞及儀器、試劑 人肝癌HepG2細胞株，購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)；胎牛血清（德國Biochrom公司）；DMEM高糖培養基（美國Gibco 公司）；卡比多巴、MTT、DMSO（美國 Sigma公司）；自動酶標儀（美國 BIO-RAD 550型）；高容量cDNA合成試劑盒(美國Invitrogen公司)；引物序列（中國華大基因）；Alexa Fluor 488、DAPI(美國 Molecular Probes公司)；Ⅰ、Ⅱ抗（美國 Abcam 公司）；熒光顯微鏡（瑞士MMI公司）。

1.2 細胞培養 HepG2細胞株在37℃條件下，使用DMEM高糖培養基（10%的胎牛血清、青霉素100 IU/ml、鏈霉素 100 g/L），在 5%CO2的環境中培養，并傳代10～20代。所有實驗均采用處于對數生長期的細胞，并重復3次。

1.3 MTT法測定細胞生存率 取HepG2細胞接種于96孔板中，每孔1×104個細胞，放入培養箱中培養24 h。然后按實驗要求分別加入終濃度為0、1、2.5、5、7.5、10、12.5、15 μM 的卡比多巴。 以上各組每天棄上清，并更換一次卡比多巴，2 w后終止培養。向每個孔中加入MTT(20 μl，5 g/L)和DMEM培養液（180 μl， 無血清）； 繼續培養 4 h 后， 加入 150 μl DMSO，37℃下溶解10 min。然后放入自動酶標儀，測定吸光度值（A570nm），并按照下面的公式計算細胞生存率：細胞生存率=（實驗組A570nm值）/（對照組A570nm值）×100%。

1.4 實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）測定細胞中CYP1A1、CYP1A2和 CYP1B1 mRNA的表達 取HepG2細胞，將其制成單細胞懸液，以每孔1.8×105個細胞接種6孔板，待細胞貼壁生長良好后，分別加入卡比多巴（0、10、50 μM）、CH223191（0、10 μM），作用6 h，提取各組細胞的RNA。使用高容量cDNA合成試劑盒逆轉錄合成cDNA。引物序列見表1。反應條件：預變性 95 ℃，30 s；變性 95 ℃，5 s；退火、延伸60℃，30 s， 共40個循環；65～95℃（每次增加0.5℃）測定熔解曲線。擴增得到的Ct值使用2-ΔΔCt法計算目的mRNA的相對表達量。

1.5 免疫熒光觀察AhR表達 使用4%多聚甲醛固定細胞，加入Ⅰ抗（小鼠抗 AhR 抗體）（1∶50），在4℃條件下孵育45 min；再加入Ⅱ抗（羊抗鼠IgG，綠色）（1∶400）在37 ℃條件下孵育 2 h；接著加入 DAPI染色5 min；然后在熒光顯微鏡下觀察。

表1 PCR引物序列

1.6 統計學方法 應用SPSS20.0軟件分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LST-t檢驗，假設檢驗水準a=0.05。

2 結果

2.1 不同濃度卡比多巴對HepG2細胞生長的抑制作用不同濃度的卡比多巴 （1、2.5、5、7.5、10、12.5、15 μM）對HepG2細胞增殖均有顯著的抑制作用（P<0.05），且呈現濃度依賴性（圖 1）。

圖1 不同濃度卡比多巴對HepG2細胞生長的抑制作用

2.2 不同濃度卡比多巴對 CYP1A1、CYP1A2和CYP1B1基因表達的影響 卡比多巴顯著增加了CYP1A1、CYP1A2和 CYP1B1 mRNA 的含量(P<0.05)，且呈現顯著的濃度依賴性（圖 2、3）。

圖2 不同濃度卡比多巴對于CYP1A1 mRNA表達水平的影響

圖3 不同濃度卡比多巴對于CYP1A2和CYP1B1 mRNA表達水平的影響

2.3 CH223191抑制卡比多巴的阻斷作用 卡比多巴可顯著增加CYP1A1 mRNA的相對水平（P<0.05）；加入 CH223191（AhR 的特異性拮抗劑）后，可有效阻斷卡比多巴對于CYP1A1基因表達的激活作用（P<0.05，圖 4）。

圖4 CH223191阻斷卡比多巴對于CYP1A1基因表達的激活作用

2.4 卡比多巴處理導致AhR的激活 免疫組化染色顯示，相比于空白對照組，卡比多巴處理的實驗組細胞核（藍色）中出現了AhR（綠色），提示AhR被激活，并發生核轉移（圖5）。

圖5 卡比多巴激活AhR并發生核轉移（×100）

3 討論

卡比多巴通過抑制外周多巴脫羧酶來防止左旋多巴轉化為無法通過血腦屏障的多巴胺[8]，從而喪失藥效。因此，其多與左旋多巴配伍，常用于PD的輔助治療。臨床推薦用量為50～100 mg/d，但即使將其用量提高到450 mg/d，仍具有很高的安全性[9]，證明其毒副作用小。本實驗結果顯示，較低濃度（1 μM）的卡比多巴即可顯著抑制HepG2細胞的生長增殖，且呈現濃度依賴性，證實其具有高效的抗癌作用。

受到卡比多巴分子結構的啟發，推測其藥理作用的靶點可能是AhR。它是一種配體依賴性的轉錄因子，通過與不同配體的結合而激活，后以異二聚體復合物的形式發生核轉移，通過經典/非經典多條信號傳導通路激活下游靶基因[10]。研究表明，AhR在多種腫瘤組織中表達上調，包括肝癌[11]。AhR活化后改變腫瘤細胞周期，促進其生長增殖，并抑制凋亡[5]；同時降低其的接觸能力，增加轉移和侵襲的可能[12]。陳艷美等[13]利用RNA干擾HCCLM3細胞中的AhR，發現HCCLM3細胞的增殖和遷移能力顯著降低；將RNA干擾的HCCLM3細胞注射到裸鼠體內，其腫瘤生長也受到了顯著的抑制。本實驗通過免疫組化染色顯示，卡比多巴引起了AhR激活并發生核轉移；RT-PCR結果顯示，卡比多巴導致3種目標基因 CYP1A1、CYP1A2和 CYP1B1 mRNA水平的增高。同時，添加CH223191可有效阻斷了CYP1A1的轉錄，這些均證明卡比多巴是通過激活AhR來發揮其抗腫瘤作用，這與文獻描述相矛盾。究其原因，可能是因為AhR具有配體依賴性和雙重調控性。配體依賴性是指不同類型的配體同樣作用于AhR，但最終可能產生促癌和抑癌兩種截然不同的結果，如多環芳烴、鹵代芳烴等配體結合AhR后，主要發揮促癌作用；而苯并噻唑、氨基黃酮等配體結合AhR后，則主要發揮抑癌作用[14]。雙重調控性是指同一種配體在兩種不同的環境中與AhR結合，但結果可能分別表現為活化和抑制AhR，如山柰酚在MCF-7細胞中表現為AhR的激動劑，誘導細胞死亡；而在含有TCDD的環境中，山柰酚則表現為AhR的拮抗劑，減少代謝毒物，發揮細胞保護作用[15]。卡比多巴可能就是一種特異性配體，通過與AhR結合，誘導其構象改變，活化并產生抑制肝癌細胞生長增殖的生物學效應。但具體的作用機制尚不清楚，有待在后續的實驗中進一步深入研究。

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