參萸補血方對再生障礙性貧血模型小鼠Th17細胞及其相關因子IL—6、IL—17及IL—23表達水平的影響

曾清 陸海頌 程緯民 何艾 鄧德君 賴春鳳

[摘要] 目的 觀察參萸補血方對再生障礙性貧血（AA）模型小鼠Th17細胞及其相關因子白細胞介素6（IL-6）、IL-17及IL-23表達水平的影響，探討其治療AA的效果。 方法 選取清潔級BALB/c小鼠80只，按隨機數字表法分為正常對照組、模型組、參萸補血方組、強的松（陽性對照）組。以60CO-γ射線照射加腹腔注射環磷酰胺（CY）加氯霉素（CH）復合方法建立AA小鼠模型。造模成功后給藥干預，連續4周后觀察各組小鼠外周血象改變及各組小鼠Th17細胞及其相關因子IL-6、IL-17及IL-23表達水平的變化，光鏡下觀察骨髓增生程度。 結果 與正常對照組比較，模型組小鼠外周血象和骨髓增生明顯降低，Th17細胞及其相關因子IL-6、IL-23和IL-17表達均顯著升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。與模型組比較，參萸補血方組小鼠外周血像明顯升高，Th17細胞及其相關因子IL-6、IL-23和IL-17表達水平下降，骨髓增生明顯改善，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 參萸補血方可改善AA模型小鼠的骨髓造血功能，可能與其抑制T細胞免疫功能相關的IL-6、IL-17及IL-23表達水平有關。

[關鍵詞] 再生障礙性貧血；參萸補血方；Th17細胞；白介素17；白介素6

[中圖分類號] R556.53 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）04（c）-0013-04

Effects of Shenyu Buxue Decotion on the Th17 cells and expression of its related IL-6， IL-17 and IL-23 expression in mice with aplastic anemia

ZENG Qing1 LU Haisong1 CHENG Weimin1 HE Ai1 DENG Dejun2 LAI Chunfeng3

1.Department of Hematology， the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530023， China； 2.Graduate School， Guangxi University of Chinese Medicine， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 500001， China； 3.Department of Oncology， Yullin Traditional Chinese Medicine Hospital， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Yulin 537000， China

[Abstract] Objective To observe the effect of Shenyu Buxue Decotion on Th17 cells and the expression of IL-6， IL-17 and IL-23 in aplastic anemia （AA） model mice， and to explore its curative effect for AA. Methods Eighty clean-class BALB/c mice were divided into control group， model group， Shenyu Buxue Decotion group and Prednisone （positive control） group by random number table. The AA models were established by irradiated with 60CO-γ ray together with intraperitoneal injection of cyclophosphamide （CY） and chloramphenicol （CH）. After AA models were successfully established， mice were given to medicines for 4 weeks. The changes of mice peripheral hemogram， Th17 cells and the expression levels of IL-6， IL-17 and IL-23， and the degree of bone marrow hyperplasia under light microscope were observed. Results Compared with the control group， the peripheral hemogram and bone marrow hyperplasia were decreased， while Th17 cells and expression of IL-6， IL-23 and IL-17 were increased in the model group， with statistically significant difference （P < 0.05）. Compared with the model group， in the Shenyu Buxue Decotion group， the peripheral hemogram were increased， Th17 cells and the expression of IL-6， IL-23 and IL-17 were decreased， and bone marrow hyperplasia was improved， with statistically significant difference （P < 0.05）. Conclusion Shenyu Buxue Decotion can improve the bone marrow hematopoietic function of AA mice， which may due to the inhibition of the T cell immune function related IL-6， IL-17 and IL-23.

[Key words] Aplastic anemia； Shenyu Buxue Decotion； Th17 cell； IL-17； IL-6

參萸補血方由黨參、山萸肉、茯苓、仙靈脾、白術、杜仲等組成，具有溫補脾腎的功效，臨床用于再生障礙性貧血（AA）治療，效果顯著，觀察發現免疫調節是其主要療效機制之一。本研究通過觀察參萸補血方對AA小鼠骨髓增殖及T細胞免疫功能及其相關的白細胞介素6（IL-6）、IL-17及IL-23表達水平的影響，探討其治療AA的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 BALB/c小鼠80只，雄性，SPF級，體重18～22 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。實驗動物許可證編號：SCXK（湘）2013-0004。

1.1.2 主要藥品及試劑 環磷酰胺（Cyclophosphamide，CY），江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：16092225。氯霉素（Chloramphenicol，CH），陜西省西安婦幼制藥廠，批號：912525。醋酸潑尼松片，天津力生制藥股份有限公司，批號：1607021。IL-6試劑盒，cusalio，編號：CSB-E04639m。IL-23試劑盒，cusalio，編號：CSB-E08463m。IL-17試劑盒，欣博盛生物科技有限公司，編號：EMC008CH。中藥材由廣西中醫藥大學第一附屬醫院（以下簡稱“我院”）藥劑科提供。

1.1.3 儀器 美國VARIAN電子直線加速器，邁瑞BC-1800plus全自動血液分析儀，德國EPPENDORF 5418產離心機，美國Thermo酶標儀，Olympus BEION V4.2型顯微鏡等。

1.2 實驗方法

1.2.1 AA小鼠模型的建立 AA小鼠模型建立：第1天BalB/C小鼠1次全身3 Gy 60CO-γ射線均勻照射，能量8 Me-V，單次劑量300 cGy，源皮距100 cm，照射時間1 min[1-2]。照射后第4～6天各行1次腹腔注射（ip）CY 50 mg/kg及CH 62.5 mg/kg[2-3]。自由飲水。至第2周末，形成AA模型。

1.2.2 動物分組與給藥 80只清潔級雄性BalB/C小鼠按隨機數字表法分為正常對照組、參萸補血方組、強的松（陽性對照）組、模型組4組。正常對照組不造模，普通飼料喂養，自由飲用蒸餾水；根據實驗方法學，人鼠折算公式計算，參萸補血方組小鼠以30 mg/（kg·d）的藥物濃度灌胃；陽性對照組以藥物濃度為9.1 mg/（kg·d）的潑尼松片灌胃；模型組以10 mL/（kg·d）生理鹽水灌胃，至第4周末實驗結束。

1.3 觀察指標

1.3.1 動物一般情況 在實驗過程中，每天觀察并記錄各組小鼠的飲食、活動、毛色、體重和死亡情況。

1.3.2 標本處理 實驗結束，處死各組小鼠。各組小鼠通過摘取眼球、眼眶取血備用，隨后頸椎脫臼處死，分離出雙側股骨。剪截取右側股骨中段7 mm處，用空氣快速吹打出骨髓液，制成骨髓涂片，瑞氏-吉姆薩染色，送我院檢驗科觀察骨髓象。

1.3.3 檢測方法 光鏡下評估骨髓增生程度及骨髓非造血細胞（包括淋巴細胞、單核細胞、漿細胞等）百分率變化。瑞氏染色骨髓增生程度判斷標準如下：增生極度減低（-），紅細胞與有核細胞之比為100～300∶1；增生減低（+），紅細胞與有核細胞之比為35～70∶1；增生活躍（++），紅細胞與有核細胞之比為16～32∶1；增生明顯活躍（+++），紅細胞與有核細胞之比為5～12∶1；增生極度活躍（++++），紅細胞與有核細胞之比為0.5～2.0∶1。

外周血象送我院檢驗科進行外周血象計數；采用流式細胞儀檢測PBMCs的Th-17/CD4+細胞比例；用ELISA檢測血清IL-6、IL-23、IL-17的水平，按試劑盒操作說明書進行。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；等級資料采用Kruskal-Wallis檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

正常組小鼠一般情況良好，毛被光澤，行動靈活，食量及大便正常。模型組小鼠形體消瘦，精神不振，行動遲緩，行走不穩，食量明顯減少，毛色無光澤易脫落；經治療后，參萸補血方組和強的松組小鼠活動正常，一般情況較模型組明顯好轉。

2.2 外周血象

與正常對照組比較，模型組小鼠外周血中白細胞（WBC）、血紅蛋白（HGB）和血小板（PLT）數量減少，差異均有統計學意義（P < 0.05）。與模型組比較，參萸補血方組與強的松組小鼠外周血中WBC、HGB和PLT數量增加，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.3 骨髓細胞學檢測

2.3.1 外觀取材涂片觀察 肉眼觀察：正常對照組小鼠骨髓涂片涂膜面厚薄適中，無脂肪珠，可見骨髓小粒；模型組小鼠骨髓涂片涂膜面較薄，可見脂肪珠，無明顯骨髓小粒。參萸補血方組和強的松組之間骨髓涂片肉眼觀察差別不明顯，涂膜面厚薄適中，無脂肪珠，骨髓小粒介于模型組與正常對照組之間。

2.3.2 骨髓細胞形態學分析 鏡下觀察：正常對照組小鼠骨髓全片小粒明顯，無油滴，骨髓增生活躍，有核細胞密布，各系比例大致正常，成熟紅細胞形態正常，巨核細胞多見，血小板多見，成簇分布。模型組小鼠部分骨髓涂片出現油滴，骨髓全面衰竭呈增生障礙，造血細胞減少，非造血細胞增多，成熟紅細胞大小一致，無明顯淡染區，巨核細胞缺如，血小板減少。參萸補血方組與強的松組小鼠骨髓衰竭程度明顯減輕，油滴較模型組明顯減少，僅見少量脂肪空泡，部分骨髓片可見散在造血灶，偶見巨核細胞，血小板散在。見圖1。