伴骨髓浸潤的成熟自然殺傷細胞腫瘤15例臨床和實驗室特征及預后分析*

楊再林,劉 靈,葉 楓,張 勇△

(中國人民解放軍陸軍軍醫大學第一附屬醫院：1.血液病中心；2.預防保健科，重慶 400038；3.中國人民解放軍陸軍軍醫大學預防醫學系毒理學研究所，重慶 400038)

在2008年的WHO造血與淋巴組織腫瘤分類標準中，將侵襲性自然殺傷細胞(NK細胞)白血病(ANKL)與結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤(ENKTCL)、慢性NK細胞淋巴增殖性疾病(CLPD-NK)統一歸類為成熟NK細胞腫瘤。對起源于未成熟的NK細胞腫瘤，如髓系NK前體細胞白血病和前體NK-淋巴母細胞淋巴瘤/白血病歸為白血病范疇[1]。ANKL臨床常表現為發熱、肝脾腫大、黃疸、肝功能異常和全血細胞減少，疾病進展快，療效差，短期內出現多臟器功能衰竭，中位生存期約為2個月[2]。由于對ANKL認識不足，臨床易誤診、漏診。ENKTCL好發于東亞、墨西哥和中美洲，歐美國家相對罕見，我國較多見。ENKTCL常見于成年人，男性稍多，以結外病變為主，主要侵及鼻或面中線部，臨床呈高度侵襲性，發病與EB病毒(EBV)密切相關[1]。CLPD-NK是起源于成熟NK細胞系的惡性淋巴細胞增殖性疾病，較難確認CLPD-NK中NK細胞的克隆性，臨床上常常呈惰性，與反應性NK細胞增多難以鑒別[3]。本研究回顧性分析2012年1月至2017年2月經中國人民解放軍陸軍軍醫大學第一附屬醫院確診的15例伴骨髓浸潤(MBI)的成熟NK腫瘤患者的臨床資料，對其臨床特征與相關血液學指標及預后進行分析，為臨床診治提供更全面的依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 以2012年1月至2017年2月經中國人民解放軍陸軍軍醫大學第一附屬醫院確診收治的初診為伴MBI的成熟NK細胞腫瘤患者15例作為研究對象，其中ANKL患者6例，ENKTCL-MBI患者7例，CLPD-NK患者2例；男12例，女3例；年齡17～60歲，中位年齡41歲。按照2008年WHO造血與淋巴組織腫瘤分類標準[4]，并經流式細胞術檢測符合CD56+、CD4-，無TCRγδ及TCRαβ表達，無T系、B系和髓系特異性標志表達，并出現抗原異常表達及克隆性增生的NK細胞來源的腫瘤細胞。按Ann Arbor分期系統進行臨床分期，本組病例中NK/T細胞淋巴瘤MBI均為病理明確診斷NK/T淋巴瘤后經骨髓穿刺細胞形態學及流式細胞術檢測診斷為ENKTCL-MBI病例。

1.2方法

1.2.1骨髓涂片 骨髓涂片按常規進行，必要時加做鐵染色和POX染色。根據不同病理類型的成熟NK細胞腫瘤形態、大小及分化程度不同，參照FAB對ALL-L1型與ALL-L2型細胞大小劃分原則(6～12 μm為小細胞，>12～25 μm為大細胞)及形態學通用的分類辦法(主要依據核仁的有無、染色質聚集及核形規則程度綜合判斷)，將骨髓中成熟NK細胞腫瘤形態分為3種類型：(1)原始大細胞型，細胞以大細胞為主，核圓形或類圓形，核形較規則，核染色質較細致，呈顆粒狀，細胞質豐富，染色淺藍，部分可見較細小嗜苯胺藍顆粒，核仁大而明顯。(2)幼稚不規則細胞型，細胞大小不等，體積差異在2倍以上，較懸殊，大者可表現為中等大或巨大，多核不規則樣，核畸變明顯，呈凹陷、折疊、扭曲狀，核染色質粗細不定，易見瘤狀突起和偽足，染色較藍，核仁可見一個或多個；小者如淋巴組織樣細胞，體積小，核呈圓形或類圓形，較規則，染色質成熟，胞漿少量，可見偽足，核仁不明顯。(3)成熟小細胞型，以成熟小淋巴細胞為主，核圓形較規則，核染色質呈粗糙塊狀，細胞質量小，染色淺藍，可見少量較粗大的嗜苯胺藍顆粒，核仁不明顯。

1.2.2骨髓活檢 骨髓活檢按常規進行，必要時加做網硬蛋白纖維染色等。

1.2.3多參數流式細胞術檢測 采用熒光素標記的單克隆抗體及流式細胞儀檢測細胞抗原的表達、細胞大小、細胞內顆粒多少，從而識別正常與異常細胞。儀器采用美國BD公司FACS Calibur型4色流式細胞儀，采用Cellquest流式熒光定量分析軟件進行分析。每份標本分析10 000個細胞。采用熒光標記的單克隆抗體包括T、B、髓細胞系列及分化發育的抗體。其抗體有：sCD3、CD8、CD4、CD2、CD7、CD5、CD10、CD19、CD20、CD33、CD13、CD117、CD15、CD11b、CD56、HLA-DR、CD34、CD14、CD16、CD158b、CD94、CD161、CD57、cCD3、cCD79a、cMPO、CD38、CD138、CD30、Ki-67、TCRγδ、TCRαβ、CD45。單克隆抗體和配套試劑為美國BD公司產品。方法按流式細胞術檢測常規進行。

1.3觀察指標

1.3.1診斷符合率 觀察骨髓涂片異常細胞比例與流式細胞術檢測腫瘤細胞比例的差異，觀察骨髓涂片形態學與流式細胞術檢測的診斷符合率。

1.3.2骨髓形態及病理特征 觀察骨髓涂片形態學特征、骨髓活檢病理改變及網硬蛋白纖維增生情況。

1.3.3臨床表現 包括體溫、出血、肝、脾、淋巴結等。

1.3.4相關血液學指標 包括血常規、肝腎功能、凝血功能、EBV等。

1.4統計學處理 采用SPSS16.0統計軟件進行數據分析，計數資料以例數或百分率表示，采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1臨床表現 15例患者臨床特征見表1。6例ANKL患者表現為發熱、盜汗、體質量減輕，伴有不同程度的肝、脾和淋巴結腫大，5例伴有肺部感染，2例伴有噬血細胞綜合征，1例伴有消化道出血。7例ENKTCL-MBI患者3例有不同程度的肝、脾腫大，4例有不同程度的淋巴結腫大，2例伴有噬血細胞綜合征，6例表現為發熱并合并肺部感染，1例伴有肉眼血尿。2例CLPD-NK患者未見明顯肝、脾、淋巴結腫大，無發熱表現。

2.2實驗室檢查

2.2.1ANKL患者和NKTCL-MBI患者血常規檢測結果比較 見表2。2例CLPD-NK患者白細胞(WBC)分別為15.15×109/L、27.92×109/L，WBC分類以淋巴細胞增高為主，符合該類型淋巴細胞明顯增加的特點；血紅蛋白(Hb)分別為130、141 g/L，血小板(PLT)分別為25×109/L、163×109/L。6例ANKL患者及7例ENKTCL-MBI患者血常規均呈不同程度全血細胞減少，差異無統計學意義(P>0.05)。2例CLPD-NK患者血常規白細胞數明顯高于ANKL及ENKTCL-MBI患者。

表1 15例成熟NK細胞腫瘤患者臨床特征

表2 ANKL患者和ENKTCL-MBI患者血常規檢測結果比較

注：Neu#表示中性粒細胞，RBC為紅細胞

2.2.215例成熟NK細胞腫瘤患者血液生化情況 見表3。6例ANKL患者及7例ENKTCL-MBI患者均有不同程度的肝功能損害及乳酸脫氫酶(LDH)升高，部分患者有不同程度的凝血功能異常，少部分患者有腎功能損害，但差異無統計學意義(P>0.05)。而2例CLPD-NK患者均無明顯肝功能損害、LDH升高、腎功能損害及凝血功能異常，與ANKL及ENKTCL-MBI患者比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 15例成熟NK細胞腫瘤患者血液生化情況(n)

圖1 病例1 ANKL細胞形態(原始大細胞型)

圖2 病例12 ENKTCL-MBI細胞形態(幼稚不規則細胞型)

2.2.3骨髓形態及病理特點 按骨髓成熟NK細胞腫瘤形態三分類方法，骨髓形態及病理特點見圖1～3。6例ANKL患者中原始大細胞型2例，幼稚不規則細胞型4例；7例ENKTCL-MBI患者中幼稚不規則細胞型6例，成熟小細胞型1例；2例CLPD-NK患者均為成熟小細胞型。ANKL與ENKTCL-MBI患者中各有2例伴有數量不等的噬血細胞，見圖4。15例有MBI的成熟NK細胞腫瘤患者骨髓活檢均檢出呈結節狀或片簇狀腫瘤細胞，6例ANKL患者中3例伴有骨髓纖維組織增生，7例ENKTCL-MBI患者中4例伴有骨髓纖維組織增生。

圖3 病例14 CLPD-NK細胞形態(成熟小細胞型)

圖4 病例1噬血細胞

2.2.4流式免疫表型與EB-DNA檢測結果比較 15例患者EB-DNA檢測9例陽性，1例陰性，5例未測。15例患者流式免疫表型均為CD56+，并且有CD4-、CD5-、CD57-、TCRγδ-及TCRαβ-，15例患者抗體陽性率依次為CD2:93.33%(14/15)、CD94:86.67%(13/15)、CD7:73.33%(11/15)、cCD3:66.67%(10/15)、CD161:53.33%(8/15)、CD16:40.00%(6/15)、CD8:26.67%(4/15)、CD158b:20.00%(3/15)。CD16在ANKL中的陽性率為83.33%(5/6)，在ENKTCL-MBI中均為陰性，差異有統計學意義(P<0.05)。Ki-67在ANKL中平均表達水平為81.00%，表達水平最高，在ENKTCL-MBI中平均表達水平為72.00%，略低于ANKL患者，在CLPD-NK中平均表達水平最低，為20.00%。CLPD-NK與ANKL及ENKTCL-MBI比較，Ki-67表達水平差異有統計學意義(P<0.05)(表4)。

表4 15例成熟NK細胞腫瘤患者抗原表達差異(%)

2.3形態學與流式細胞術診斷符合率 15例伴MBI的成熟NK細胞腫瘤患者中，當骨髓細胞形態學異常細胞比例在5%～20%時，流式細胞術檢測中腫瘤細胞比例明顯高于骨髓細胞形態學，差異有統計學意義(P<0.05)。6例ANKL患者中，1例原始大小型骨髓細胞形態學初診誤診為急性骨髓性白血病，形態學與流式細胞術檢測的診斷符合率為83.33%(5/6)；另5例ANKL患者及7例ENKTCL-MBI患者骨髓細胞形態學雖不能明確細胞類型，但均提示為MBI；1例CLPD-NK患者初診誤診為慢性淋巴細胞白血病(CLL)，形態學與流式細胞術檢測的診斷符合率為50.00%(1/2)；另1例CLPD-NK患者骨髓細胞形態學不能明確細胞類型，提示CLPD。

2.4治療及預后 針對原發病治療及給予對癥支持治療,6例ANKL患者中2例放棄治療，4例患者采用SMILE、COP+表柔比星等化療方案治療1個療程后均未獲得完全緩解，分別在1～4個月內死亡。7例ENKTCL-MBI患者中，4例放棄治療，3例分別采用MESA+長春地辛、CHOD+培門冬酶等化療方案治療，治療效果不佳，分別在1～9個月內死亡。2例CLPD-NK患者中，1例在隨訪13個月后病情加重，進展成ANKL后放棄治療，在1個月內死亡，另1例仍存活，目前已隨訪27個月，病情無進展。

3 討 論

2008年WHO分類標準將ANKL、ENKTCL與CLPD-NK一起歸入成熟NK細胞腫瘤，對于ANKL與CLPD-NK的診斷，國內外尚無統一的診斷標準，主要依據臨床特點、細胞形態、免疫學表型及細胞遺傳學與分子遺傳學等特征綜合考慮[1]。淋巴瘤MBI時，判斷標準按國內勇氏診斷標準，骨髓中瘤細胞數大于或等于5%時，診斷為MBI，瘤細胞數大于或等于20%時，診斷為淋巴細胞白血病[5]。

ANKL臨床較少見，本組ANKL患者均起病急、進展快，臨床呈侵襲性和暴發性，均表現為發熱、盜汗、體質量減輕，伴有不同程度肝、脾和淋巴結腫大，部分病例伴有肺部感染及噬血細胞綜合征。均有一系或多系血細胞減少及不同程度的肝功能損害，LDH升高及EB-DNA檢測陽性，與文獻[6]報道一致。ENKTCL占所有非霍奇金淋巴瘤的5%～15%，80%以上結外NK/T細胞淋巴瘤原發于鼻腔，主要累及淋巴結外組織，如皮膚、胃腸道、骨髓等。發生在鼻腔外的ENKTCL具有高度侵襲性，預后較差[7]。本組部分ENKTCL-MBI患者有不同程度的肝、脾、淋巴結腫大及伴有噬血細胞綜合征，以及不同程度凝血功能異常，多數表現為發熱合并肺部感染，均有不同程度的一系或多系血細胞減少，有不同程度肝功能損害及LDH升高。本組CLPD-NK患者白細胞明顯升高，以淋巴細胞增殖為主，未見明顯肝、脾、淋巴結腫大，無發熱表現，明顯不同于ANKL與ENKTCL的高侵襲臨床過程。由于ANKL、ENKTCL-MBI時，以及CLPD-NK發生時流式細胞術檢測均會出現異常表型NK細胞，需要結合臨床表現及實驗室檢查進行鑒別。

骨髓細胞形態學及骨髓活檢是血液系統腫瘤及淋巴瘤MBI診斷最常用的檢查方法之一，但由于NK細胞腫瘤形態多樣，且單純通過形態很難準確區分和鑒別。本研究首次將成熟NK腫瘤細胞根據其骨髓涂片細胞形態特征分為3種類型，ANKL可以出現原始大細胞型，ENKTCL-MBI以幼稚不規則型為主，CLPD-NK以成熟小細胞型為主。據此形態學分類方法，可以給臨床診斷與鑒別診斷及進一步檢查提供思路與方向。ANKL及ENKTCL-MBI患者骨髓活檢中腫瘤細胞呈大片狀或結節狀分布，約50%以上的ANKL及ENKTCL-MBI患者骨髓存在纖維組織增生。骨髓異常細胞比例在5%～20%時,形態比例與流式細胞術檢測比例差異有統計學意義，分析其導致差異的原因是：在幼稚不規則細胞型時，由于體積大小懸殊的細胞存在，往往容易忽略體積較小的一群細胞而導致形態學腫瘤細胞比例明顯低于流式細胞術檢出比例。CLPD-NK患者骨髓多為成熟小淋巴細胞型，形態上應注意和CLL鑒別。本組流式細胞術檢測結果還顯示，CD56、CD2、CD94在成熟NK細胞中陽性率較高，CD16在ANKL中陽性率明顯高于ENKTCL-MBI，由此提示在ANKL與ENKTCL-MBI的鑒別診斷時有一定價值。Ki-67在ANKL與ENKTCL-MBI中無明顯差異，但與CLPD-NK有明顯差異，Ki-67陽性率的升高可以作為疾病侵襲性增加的依據。形態和流式細胞術檢測結果相結合，可以對NK細胞腫瘤作出較準確的病理分型診斷與鑒別。

根據文獻[1]及本組資料顯示，ANKL與ENKTCL-MBI鑒別點如下：(1)免疫表型,CD16在ENKTCL-MBI中陽性率明顯低于ANKL，可作為鑒別點之一。(2)臨床特點，80% ENKTCL病例累及鼻和鼻旁組織并易侵犯皮膚，而ANKL的鼻和鼻旁組織及皮膚侵犯少見，也可作為二者的鑒別點。(3)骨髓細胞形態，ENKTCL骨髓侵犯時，骨髓形態以細胞大小混雜的幼稚不規則細胞型為主，當形態為原始大細胞型時，結合流式的NK細胞免疫表型可作出更傾向于ANKL的診斷，亦可以作為潛在的鑒別點，該觀點在既往研究中少有報道。由于CLPD-NK臨床表現為惰性，明顯不同于ANKL與ENKTCL的高侵襲臨床過程，并且CLPD-NK外周血NK細胞絕對值≥2×109/L持續6個月以上,據此可以和ANKL及ENKTCL相鑒別。少數患者出現血細胞減少、皮膚脈管炎、周圍神經病變和脾臟腫大及急性腎小球腎炎等，但也可能進展為侵襲性NK細胞白血病[8]。由于難以確認CLPD-NK中NK細胞的克隆性,臨床上排除繼發性NK細胞增多仍比較困難。根據文獻[9-11]報道，確認NK細胞的克隆性有以下方法：(1)KIRs的限制性表達可能作為CLPD-NK的克隆性證據。(2)30%的CLPD-NK患者存在STAT3基因突變,并提示可能預后更差,可以與反應性NK細胞鑒別。(3)CLPD-NK有與正常NK細胞明顯不同的免疫表型。本組資料中2例CLPD-NK患者初診時均出現無誘因的白細胞持續性增高,形態以含有顆粒的成熟小淋巴細胞為主，流式檢測均為異常成熟NK細胞表型，未見明顯肝、脾、淋巴結腫大。其中1例已隨訪27個月，未給予任何特殊干預措施，病情無進展。另1例初診誤診為CLL，經流式檢測后修正診斷，隨訪13個月后出現發熱、肝腎功能異常、LDH增高、凝血功能異常等，疾病進展為ANKL后放棄治療，1個月后患者死亡，提示該類疾病雖然病程偏惰性，仍需密切隨訪。

本組ANKL患者治療效果欠佳，均在4個月內死亡，符合ANKL疾病進展迅猛、預后差的臨床特點。本組ENKTCL-MBI患者在治療1～9個月內死亡，疾病進展略慢于ANKL。本組資料中，絕大多數ANKL及ENKTCL-MBI患者有高熱，肝、脾、淋巴結腫大等體征，絕大多數有不同程度的全血細胞減少及LDH升高。有研究報道，采用聯合化療及造血干細胞移植能延長患者生存期[12-13]。CLPD-NK往往呈現白細胞及淋巴細胞比例增高，臨床表現更惰性，不同于ANKL與ENKTCL的高侵襲臨床過程，但仍可能進展為ANKL。由于骨髓形態多樣、極不典型，結合患者臨床表現、血常規情況、骨髓細胞形態分類特征及流式檢測能提高其診斷符合率，提高對該病的認識,做到早期診斷及鑒別診斷,才能為進一步治療贏得時間。

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