熒光探針偶聯GPC3單鏈抗體對肝癌的體內外檢測研究

杜恩輔，徐 霖，周選民，劉梅訊，張曉龍，崔 寧，侯平志，余惠芬

(湖北醫藥學院附屬十堰市太和醫院醫學影像中心 442000)

肝細胞癌(HCC)是最常見的肝癌亞型，發病率占全球第5位[1]，HCC確診后的5年生存率不足12%[2]。分子靶向藥物為肝癌治療提供了新的策略[3-4]，磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC)3是肝素硫酸多糖家族的一個膜蛋白[5]。自1997年有學者首先發現GPC3的mRNA在HCC組織中高度表達后，多個研究團隊對GPC3的生物學特性進行分析發現，GPC3在超過70%的HCC中表達，在正常肝組織中不表達[6-7]。因此，GPC3是一種腫瘤特異性抗原，在腫瘤分子免疫靶向治療方面有重要應用前景。基于GPC3的高表達，羅氏公司研發出Codrituzumab成為GPC3陽性肝癌的潛在治療手段[8]。本研究以GPC3為靶點設計了單鏈抗體，并將單鏈抗體與熒光染料結合，使其在體內外對GPC3陽性腫瘤都有很好的靶向性，并使其生物相容性增加，半衰期延長，為實驗室研究或臨床檢測提供了新的手段與技術 ，現報道如下。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 DMEM培養基購自Life公司；蛋白Marker購自美國伯樂公司；異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯羊抗人IgG-Fc單克隆抗體購自南賽博生物公司；胎牛血清(FBS)購自美國Invitrogen公司；羅丹明B熒光染料購自上海碧云天公司； Balb/c裸鼠購自南京大學模式動物所；(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購自南京晚晴公司；活性近紅外熒光基團(NIRB-NHS)試劑盒購自上海科遠迪生物科技有限公司；細胞培養瓶及相關培養耗材購自美國熱電公司。

1.2方法

1.2.1融合蛋白表達及純化 通過GeneBank數據庫搜索Codrituzumab輕鏈與重鏈可變區蛋白序列，使用G4S柔性肽將二者連接在一起，并通過畢赤酵母偏愛密碼子優化后送公司合成，導入工程質粒中。采用畢赤酵母X-33表達系統，發酵液經硫酸銨沉淀法初步提取后采用鎳柱進一步分離純化得到電泳純蛋白，最后利用Western Blot對純化得到的蛋白進行鑒定，以期獲得高產量、高純度的融合蛋白。

1.2.2流式細胞術 制備Huh-7單細胞懸液，細胞數在106個/組。分為單鏈抗體組和脫脂牛奶空白對照組。每組分別加入250 μL相應的抗體或脫脂牛奶，抗體濃度為200 μg/mL，冰上孵育1 h，洗滌，孵育鼠抗His抗體，洗滌，再孵育FITC-偶聯的羊抗人IgG抗體，洗滌，上機檢測。使用FlowJo 7.6.1對流式數據進行處理。

1.2.3激光共聚焦體外成像試驗 取羅丹明B 4.79 mg溶于1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH為7.2)中，加入EDC、NHS，摩爾比羅丹明B∶EDC∶NHS=1.0∶1.1∶1.2，避光反應4 h，活化。反應后溶液再加入一定量的單鏈抗體(scFv)，摩爾比羅丹明B∶scFv=1.0∶1.2，繼續避光攪拌反應，6 h后停止反應得到產物粗品。使用超濾管純化，5 000 r/min離心10 min。將1 mL羅丹明B-scFv加入到已培養24 h的Huh-7細胞中，37 ℃孵育2 h，以PBS洗2遍即可使用激光共聚焦觀察內吞情況。

1.2.4近紅外體內成像試驗 本研究分為兩組，試驗組為Anti-GPC3 scFv組，另設置一個探針封閉組(Blocking組)。首先制備NIRB-Anti-GPC3 scFv熒光探針，將1 mg NIRB-NHS粉末溶于100 μL的DMSO中，濃度為0.01 mg/μL；將配制好的染料立即逐滴加入保存于含有Anti-GPC3 scFv(水平為10 mg/mL)的PBS中，放至搖床室溫反應2 h；反應結束后，將反應液加入超濾管中進行超濾，4 000 r/min 離心30 min，重復3次，取超濾管上層溶液，凍干可得到標記近紅外線熒光探針(IRB)的相應固體粉末。Blocking組是將熒光探針NIRB-Anti-GPC3 scFv與Anti-GPC3 scFv按物質的量1∶50混合制備Blocking組探針，終濃度為50 μmol/L。建立Huh-7荷瘤小鼠動物模型，收集對數生長期Huh-7細胞，1 000 r/min離心3 min后用生理鹽水重懸，調整細胞密度為5×106個/mL，取200 μL細胞懸液接種于裸鼠左側腋皮下。待腫瘤體積接近80 mm3，經尾靜脈注射試驗組探針及 Blocking 組探針100 μL。注射0、4、8、12 h后，分別對兩組小鼠進行近紅外成像拍照。使用CCD照相機實時收集熒光信號，對結果拍照并分析。

2 結 果

2.1單鏈抗體Anti-GPC3 scFv的WB驗證及親和力驗證 見圖1。Codrituzumab輕鏈與重鏈可變區蛋白序列通過PCR將二者采用G4S柔性肽連接在一起并導入工程質粒中，畢赤酵母X-33進行表達。經過硫酸銨沉淀法和鎳柱純化得到單鏈抗體Anti-GPC3 scFv，并進行WB驗證，Anti-GPC3 scFv的相對分子質量為28×103。獲得了純度較高且裝配正確的單鏈抗體Anti-GPC3 scFv。

注：A為WB驗證單鏈抗體Anti-GPC3 scFv相對分子質量；M為蛋白marker；1為純化的單鏈抗體Anti-GPC3 scFv； B為單鏈抗體Anti-GPC3 scFv與Huh-7細胞的結合驗證

圖1單鏈抗體Anti-GPC3 scFv的WB驗證及親和力驗證

2.2Anti-GPC3 scFv與Huh-7細胞結合率 抗GPC3的單鏈抗體Anti-GPC3 scFv能有效結合到HCC Huh-7細胞表面。Anti-GPC3 scFv與Huh-7細胞的結合率為40.3%，表明制備的單鏈抗體Anti-GPC3 scFv仍然保留有母體抗體的結合活性。

2.3激光共聚焦試驗驗證Anti-GPC3 scFv的體外靶向性 見圖2。通過激光共聚焦成像試驗驗證單鏈抗體Anti-GPC3 scFv的體外靶向性，其可在體外很好地靶向HCC Huh-7細胞。在單鏈抗體與熒光染料羅丹明B偶聯后，經過與Huh-7細胞2 h孵育，通過激光共聚焦成像觀察并拍攝了細胞水平的成像照片，并通過Image J軟件對圖片進行分析。試驗結果表明，單鏈抗體組細胞平均熒光強度為218.61±9.03，明顯優于阻斷對照組的31.74±5.28。通過激光共聚焦試驗可以確定設計的單鏈抗體Anti-GPC3 scFv與羅丹明B偶聯后可很好地進行HCC Huh-7細胞的體外檢測，為進一步體內靶向性試驗奠定基礎。

圖2 激光共聚焦試驗驗證Anti-GPC3 scFv的體外靶向性

2.4近紅外成像試驗驗證Anti-GPC3 scFv的體內靶向性 見圖3。本試驗使用NIRB-NHS試劑盒將熒光基團與抗單鏈抗體Anti-GPC3 scFv偶聯，制成NIRB-Anti-GPC3 scFv熒光探針，通過近紅外成像系統對NIRB-NHS定位，觀察抗體的體內靶向性。從試驗結果可以發現，尾靜脈注射NIRB-Anti-GPC3 scFv后，單鏈抗體首先由尾靜脈進入心臟；4 h時單鏈抗體在全身彌散并開始經膀胱代謝，腫瘤組織有Anti-GPC3 scFv富集，其他組織無富集；6～12 h時體內Anti-GPC3 scFv經膀胱代謝逐漸減少，在8 h時腫瘤組織仍有微弱富集。從Blocking試驗可以看出，NIRB-Anti-GPC3 scFv的靶向效果可被Anti-GPC3 scFv競爭性抑制。試驗組與 Bolcking組在注射后8 h時腫瘤組織的熒光信號與正常組織熒光信號比值分別為8.27±2.94和1.09±0.63，差異有統計學意義(P<0.05)。體內近紅外試驗驗證了Anti-GPC3 scFv的體內靶向性，其可以在體內準確地靶向HCC，有開發為檢測試劑的潛能。

圖3 近紅外成像試驗驗證Anti-GPC3 scFv的體內靶向性

3 討 論

近年來，醫學與生命科學交叉應用的關鍵技術——科學醫學影像學成為臨床檢測的研究重點。隨著熒光成像技術的逐漸發展，其在細胞成像、心血管成像、近紅外熒光分析、微量生物活性物質檢測等生物醫學工程領域被廣泛應用[9]，尤其在腫瘤成像領域有很好的前景。但是大多數熒光試劑的相對分子質量較小，靶向性差，并且在體內半衰期短，很難達到檢測要求。GPC3是HCC研究的熱門靶點，其在HCC腫瘤細胞表面呈高表達，與腫瘤的發生和發展有關，其主要在原發性HCC及癌旁組織中表達,沒有發現其在良性肝病肝細胞、膽管細胞癌及正常肝組織中表達[10]。由于GPC3在HCC中呈高表達，其有很大的潛力開發成為一種試驗和臨床檢測的靶點[11]。與原核細胞展示型抗體庫相比,采用哺乳動物抗體庫篩選獲得的修飾后單鏈抗體相對于原核細胞抗體庫有更好的低免疫原性和特異性。此外，全長抗體比單鏈抗體的穩定性及半衰期更高、更長,其Fc段可以和靶細胞Fc段結合,從而激活補體介導的細胞免疫[12-13]。因此,全長全人源的抗GPC3抗體在原發性HCC的診斷和治療上有巨大潛力。

由于單鏈抗體相對于全長抗體的優勢在于其相對分子質量較小，生產成本較低，并且擁有更好的體內外滲透性，故在檢測領域擁有較好的應用價值。通過單鏈抗體與熒光染料的偶聯，不僅可以發揮單鏈抗體較強的靶向能力，還可應用熒光探針檢測的方便與準確，同時克服熒光染料在體內靶向性差和半衰期短等問題，是一種很好的檢測手段，具有研究價值和開發潛力[14]。因為GPC3特異地表達在HCC細胞表面，而臨床研究顯示，使用單克隆抗體靶向GPC3可引發抗體依賴的細胞毒反應。Codrituzumab作為羅氏公司開發的全長全人源抗GPC3抗體，可有效治療GPC3陽性HCC。有研究發現，在藥物暴露劑量、外周血免疫細胞表達CD16及GPC3高表達的腫瘤患者中，Codrituzumab可以延長無進展生存期或總生存期，且Codrituzumab沒有顯示出特殊的毒副作用[15]。

本研究成功構建并表達單鏈抗體Anti-GPC3 scFv，并進行了Anti-GPC3 scFv體內外靶向性驗證，流式細胞結合試驗結果顯示，單鏈抗體Anti-GPC3 scFv對HCC Huh-7細胞保持很好的體外結合能力。同時體外激光共聚焦試驗驗證了單鏈抗體Anti-GPC3 scFv與羅丹明B偶聯后可很好地對HCC Huh-7細胞進行靶向，并且熒光效果明顯，可以作為體外HCC細胞檢測的重要手段。通過進一步的體內試驗，本研究將單鏈抗體Anti-GPC3 scFv與NIRB-NHS進行偶聯，獲得了在體內也擁有熒光活性的單鏈抗體。試驗結果表明，單鏈抗體Anti-GPC3 scFv可以很好地在體內靶向HCC細胞，并且通過成像手段檢測到清晰的熒光信號。

綜上所述，相對于單純的單鏈抗體或熒光染料，本研究設計的單鏈抗體Anti-GPC3 scFv偶聯熒光染料的探針可以很好地對HCC細胞進行體內外靶向。這種偶聯手段簡單易行，而且熒光信號較強，可以作為試驗檢測或臨床檢測的手段，有進一步開發的潛力。

[1]曾輝,黃緒群,宋文玲,等.多種血清標記物聯合檢測對肝癌早期診斷的臨床價值[J].實用癌癥雜志,2015,30(5):648-650.

[2]修陽陽,趙建農,郭大靜,等.基因靶向治療肝癌的新進展[J].檢驗醫學與臨床,2016,13(10):1424-1426.

[3]黃述婧，婁金麗．肝癌診斷技術方法應用進展[J]．標記免疫分析與臨床，2016，23(4)：466-469．

[4]魏杰,王志國,朱誠,等.熒光染料偶聯抗HER-2單鏈抗體對乳腺癌的體內外檢測研究[J].標記免疫分析與臨床,2017,24(6):647-650.

[5]史國軍，山廣志，葉興濤．肝癌從脾論治與靶向治療的相關性探討[J]．中華中醫藥學刊，2013，31(11)：2501-2502．

[6]張朋軍,田亞平.外周血多參數基因診斷模型對于原發性肝細胞癌診斷價值的評價[J].標記免疫分析與臨床,2014,21(5):499-502.

[7]FILMUS J,CAPURRO M.Glypican-3:a marker and a therapeutic target in hepatocellular carcinoma[J].FEBS J,2013,280(10):2471-2476.

[8]YAMAUCHI N,WATANABE A,HISHINUMA M,et al.The glypican 3 oncofetal protein is a promising diagnostic marker for hepatocellular carcinoma[J].Mod Pathol,2005,18(12):1591-1598.

[9]朱波,肖亞雄,彭宇生,等.GP73、GPC3和AFP聯合檢測在原發性肝癌診斷中的探討[J].重慶醫學,2016,45(10):1367-1369.

[10]曾靜，王津京，劉然，等．靶向CD20和HLA-DR分子Crossmab的設計與構建表達[J]．標記免疫分析與臨床，2014，21(5)：557-563．

[11]陸慧琦,耿紅蓮,孫靜,等.Her2/neu基因定量檢測方法的建立[J].現代檢驗醫學雜志,2008,23(4):11-14.

[12]盛唯瑾，苗慶芳，甄永蘇．抗表皮生長因子受體噬菌體抗體庫的構建篩選及單鏈抗體可溶性表達[J]．藥學學報，2009，44(6)：597-602．

[13]路翔宇，龔軍，許建，等．磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3在肝細胞肝癌病理診斷中的價值及應用[J]．實用醫院臨床雜志，2017，14(3)：12-15．

[14]高國輝，王金丹，黃奇迪，等．融合蛋白anti-HER2-ScFv-GFP在昆蟲細胞中的表達及其靶向結合乳腺癌細胞的功能分析[J]．中國病理生理雜志，2011，27(5)：1034-1040．

[15]ABOUALFA G K,PUIG O,DANIELE B,et al.Randomized Phase Ⅱ placebo controlled study of codrituzumab in previously treated patients with advanced hepatocellular carcinoma[J].J Hepatology,2016,65(2):289-295.