CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞與2型糖尿病腎病的相關性研究*

李小峰，廖 靜

(1.廣東省深圳市龍崗區人民醫院檢驗科 518172；2.廣東省深圳市龍崗區疾病預防控制中心 518172)

糖尿病是一種以高血糖為主要特征的內分泌代謝性疾病，隨著經濟的發展已經成為三大嚴重威脅人類健康的疾病之一[1]。糖尿病以1型和2型為主，其中2型糖尿病約占95%。由于其起病隱匿，病程緩慢，患病初期多無明顯癥狀，經常在發生不可逆的并發癥時才引起重視。糖尿病腎病(DKD)是2型糖尿病患者常見的嚴重并發癥之一，主要病理特征為腎小球硬化，由多種因素共同作用所致[2-3]。有研究表明，機體的細胞免疫調節異常可能在DKD的發病過程中起重要作用[4-7]。叉頭轉錄因子3(FOXP3)是調節性T細胞(Treg)發育和功能的必須因子，對維持免疫耐受有重要作用，因而其在DKD病程中的作用也備受關注[8-10]。本研究擬探討2型糖尿病不同病程中CD4+CD25+Foxp3+T細胞表達率與DKD的關系，旨在闡明2型糖尿病及DKD潛在的發病機制，為疾病診治提供新思路，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 以2015年7月1日至2016年12月30日在深圳市龍崗區人民醫院就診的健康體檢者和2型糖尿病患者120例作為研究對象。參考《糖尿病腎病防治專家共識(2014年版)》標準，依據血糖代謝狀態、24 h尿蛋白排泄率(UAER)等指標并結合確診病歷信息，將研究對象分為對照組、糖尿病前期組、糖尿病無腎病組、DKD組，每組各30例。對照組男15例，女15例，平均年齡(37.2±12.6)歲，見表1。

表1 研究對象分組及依據

注：-表示無數據

1.2排除標準 腫瘤，妊娠，除DKD以外的其他腎臟疾病、泌尿系統炎癥、結石、急慢性炎癥性疾病、嚴重肝病、嚴重心血管疾病及6個月內發生過心肌梗死、心絞痛、腦梗死等心腦血管事件，血液系統疾病、慢性阻塞性肺疾病、自身免疫性疾病。

1.3試劑與方法

1.3.1外周血CD4+CD25+Foxp3+T細胞表達率 采用美國BD公司Anti-Human Foxp3 Staing試劑盒(BD560132)，內含抗CD4-FITC抗體、抗CD25-PE抗體和抗Foxp3-Alexa Fluor抗體，采用美國BD公司流式細胞儀測定。

1.3.2UAER 入選糖尿病患者2日內避免劇烈運動，正常飲食，記錄24 h尿量，取晨尿標本10 mL送檢，采用全自動生化分析儀檢測。

1.3.3糖化血紅蛋白(HbA1c) 采用美國BD公司血紅蛋白測試系統，以高壓液相色譜法檢測糖尿病患者全血中HbA1c。參考2010年美國糖尿病學會制定的糖尿病診斷標準，結合儀器運行實際情況，將全血HbA1c的正常范圍確定為3.8%～5.8%。

1.3.4空腹血糖(FPG)、血脂4項測定 FPG、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)采用全自動生化分析儀檢測。

2 結 果

2.1各組研究對象基本情況比較 各組研究對象基本資料見表2。各組患者在性別、TC、LDL-C方面比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，而在年齡、HbA1c、FPG、TG和HDL-C方面比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組研究對象基本情況比較

注：與對照組比較，#P<0.05；與糖尿病前期組比較，*P<0.05

2.2各組研究對象CD4+CD25+Foxp3+T細胞表達率比較 見表3。各組之間CD4+CD25+T細胞表達率不同，差異有統計學意義(P<0.05)，與對照組比較，糖尿病前期組、糖尿病無腎病組、DKD組CD4+CD25+T細胞表達率均下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。CD4+CD25+Foxp3+T細胞表達在各組之間差異有統計學意義(P<0.05)。DKD組CD4+CD25+Foxp3+T細胞表達明顯低于對照組、糖尿病前期組和糖尿病無腎病組(P<0.05)，但對照組和糖尿病前期組之間CD4+CD25+Foxp3+T細胞表達率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3CD4+CD25+Foxp3+T細胞表達與其他指標的相關性 見表4。相關性分析顯示，CD4+CD25+Foxp3+T細胞表達與研究對象年齡、HDL-C、TC、LDL-C之間無線性相關(P>0.05)，HbA1c、FPG、TG、糖尿病病程與CD4+CD25+Foxp3+T細胞表達率之間呈負相關(P<0.05)。

表3 各組別研究對象外周血CD4+CD25+Foxp3+T細胞表達率比較

注：與對照組比較，#P<0.05；與糖尿病前期組比較，*P<0.05；與糖尿病無腎病組比較，△P<0.05

表4 CD4+CD25+Foxp3+T細胞表達與其他指標的相關性

3 討 論

目前，DKD已成為慢性腎衰竭的主要病因，也是糖尿病患者的主要死因之一。有研究表明，DKD患者外周血中補體3、補體4、免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD3+T細胞、CD4/CD8、B細胞和自然殺傷細胞均比健康人高[11]。提示DKD患者體內存在體液免疫和細胞免疫功能紊亂的現象。解曉琴等[5]的研究表明，單純糖尿病組與糖尿病伴腎病組比較，CD4/CD8及CD3+T細胞、CD4+T細胞表達率差異均有統計學意義(P<0.05)，提示2型糖尿病患者存在明顯的免疫系統穩態失衡，在腎損傷不同階段細胞免疫發揮重要作用。

Treg細胞是一類具有較強免疫調節作用的T淋巴細胞亞群。根據Treg細胞作用機制和表面標記不同可分為自然Treg(即CD4+Treg)和適應性Treg，其中CD4+CD25+Treg細胞是自然Treg細胞亞類的主要部分，占外周血CD4+T細胞的5%～10%，具有免疫抑制性和免疫無能性，在維持機體免疫自穩、調控免疫應答方面有極為重要的作用[11]。但CD4+CD25+T細胞包含Foxp3 Treg細胞、1型Treg細胞、活化效應T細胞和3型輔助性T細胞，各種分型作用不同，無法反映體內Treg的真實水平[12-13]。Foxp3是脊椎動物叉頭樣轉錄因子，特異表達于CD4+CD25+Treg細胞，不僅是CD4+CD25+Treg細胞發育的關鍵因子，也是Treg細胞的特征性標志，因此，CD4+CD25+Foxp3+T細胞表達率能更準確地反映CD4+CD25+Treg細胞的活性。

本研究結果發現，各組CD4+CD25+T細胞表達率比較，差異有統計學意義(P<0.05)，糖尿病前期組、糖尿病無腎病組、DKD組CD4+CD25+T細胞表達均低于對照組。張小嬌等[14]研究發現，2型糖尿病患者CD4+CD25+T細胞表達低于健康志愿者，與本研究結果一致。但本研究中糖尿病前期組、糖尿病無腎病組、DKD組之間CD4+CD25+T細胞表達差異并無統計學意義。與對照組和糖尿病前期組比較，CD4+CD25+Foxp3+T細胞表達率差異有統計學意義(P<0.05)，DKD組CD4+CD25+Foxp3+T細胞表達明顯低于其他各組，而糖尿病無腎病組CD4+CD25+Foxp3+T細胞表達低于對照組和糖尿病前期組，糖尿病前期組低于對照組，但差異并無統計學意義(P>0.05)。袁寧[15]的研究表明,初診糖尿病患者CD4+CD25+T細胞表達明顯低于健康對照組，與本研究結果相同。上述CD4+CD25+T細胞表達和CD4+CD25+Foxp3+T細胞表達不同步的現象可以解釋如下：在糖尿病前期，雖然糖耐量受損患者體內CD4+CD25+T細胞表達有所減少，但Foxp3+Treg細胞的表達并無改變，隨著病程發展，在2型糖尿病發生至DKD的過程中，患者體內可溶性IL-2受體堆積，導致IL-2對T細胞作用下降，影響T細胞增殖，進而導致Treg細胞生成障礙，CD4+CD25+Foxp3+T細胞表達降低，推測CD4+CD25+Foxp3+T細胞異常可能是DKD發生的原因之一[14-15]。為探索CD4+CD25+Foxp3+T細胞表達降低的原因，本課題組將進一步對DKD患者FOXP3基因啟動子區甲基化水平開展研究。

綜上所述，研究對象外周血中 CD4+CD25+Foxp3+T細胞表達與糖尿病病程呈負相關， 2型糖尿病患者CD4+CD25+Foxp3+T細胞表達降低，導致其介導的免疫耐受減弱，對抗內皮細胞抗體激活自身免疫反應的調節功能也隨之下降，可能導致DKD加重。因此，在DKD診治過程中，應關注機體細胞的免疫狀態[16-17]。

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