姜黃素對人食管癌Eca-109細胞放射增敏作用的研究

(青島大學，山東 青島 266003； 1 附屬醫院腫瘤科； 2 基礎醫學院)

食管癌是指原發于食管黏膜上皮的惡性腫瘤，為常見惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類的健康。在全球范圍內，食管癌居于腫瘤死因的第6位。2010年由中國國家癌癥中心發布，食管癌發病率位居我國惡性腫瘤的第5位，死亡率位居惡性腫瘤的第4位[1]。由于病人就診時多為中晚期，食管癌病人僅約25%可行食管根治術，同時研究發現經過術前放療可以提高手術切除率[2]。對于中段及上段的食管癌病人，放射治療和手術是最主要和有效的治療手段。但是由于放射治療的療效受多種因素的影響，尋找可以增敏的藥物對提高療效具有重要作用。姜黃素是從草本植物姜黃、郁金、菖蒲等根莖中提取出的一種酸性多酚類物質，具有極廣泛的藥理作用，可調控多種信號轉導分子，如趨化因子、轉錄因子、生長因子、炎性因子、細胞周期調控蛋白、酶、藥物抗性蛋白、受體、DNA等[3-6]。同時姜黃素具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗凝、抗氧化及抗類風濕等功效[7-8]。本研究旨在探討姜黃素對食管癌Eca-109細胞的放療增敏作用，以便于臨床應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人食管癌細胞系Eca-109購自中國科學院上海細胞庫。姜黃素購買自美國Sigma公司，純度為95%。胎牛血清購買自南美HyClone公司。PRIM-1640培養基購自北京賽默飛世爾公司。6 MV醫用直線加速器(型號23EX)購自美國Varian公司。流式細胞儀(型號Flow-CheckTM)購自德國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養 將人Eca-109細胞培養于含體積分數0.10胎牛血清的PRIM-1640培養液中，置于37 ℃，含體積分數0.05 CO2細胞培養箱中培養。每2～3 d細胞傳代一次，細胞貼壁生長至對數生長期，且細胞融合達70%～80%時進行后續實驗。

1.2.2CCK-8法測定姜黃素對Eca-109細胞增殖的影響 取對數生長期的細胞接種于96孔板中，每孔細胞數量約為5 000個。置于37 ℃，含體積分數0.05 CO2培養箱中過夜，待細胞貼壁時實驗組加入濃度分別為5、10、20、40和80 μmol/L的姜黃素，對照組加同等體積雙蒸水，每組設置5個復孔。將96孔板置于培養箱中孵育24和48 h，加入CCK-8。2 h后用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度(A)值。計算細胞抑制率，細胞抑制率=100%-(A加藥-A空白)/(A對照-A空白)×100%，并計算細胞抑制率為10%的姜黃素濃度，即IC10，用于測定放療增敏性的實驗濃度。

1.2.3平板克隆法測定姜黃素對Eca-109細胞的放療增敏性 取對數生長期細胞，制成細胞懸液，調整細胞懸液濃度為(5～10)×106個/L，并接種于6孔培養板中。過夜，待細胞貼壁后，將細胞分為對照組和實驗組。實驗組加入10 μmol/L姜黃素，對照組加同等體積雙蒸水，繼續培養24 h。兩組分別給予0、2、4、6、8 Gy放射線照射，然后繼續培養1 h。每2 d更換培養液，培養約2周直至出現肉眼可見的克隆時，行Giemsa染液染色，晾干，計數每個培養皿集落數，從而計算集落形成率(PE)及細胞存活分數(SF)。PE=照射劑量0 Gy時對照組的集落形成數/照射劑量0 Gy時對照組的接種細胞數×100%。SF=某一劑量照射實驗組的集落形成數/此組接種細胞數×集落形成率。存活曲線使用GraphPad Prism 5.0單靶多擊模型擬合，并計算準閾劑量(Dq)、平均致死劑量(D0)、外推數(N)、2 Gy時的細胞存活分數(SF2)和放療增敏比(SER)。

1.2.4細胞凋亡測定 取對數生長期細胞，接種于6孔板中，待細胞過夜，將細胞分為對照組和實驗組。實驗組加入10 μmol/L姜黃素，對照組加同等體積雙蒸水，繼續培養24 h，兩組分別給予0、2、4、6、8 Gy放射線照射。將經過處理的細胞離心，棄上清液，PBS充分洗滌沉淀在底部的細胞3次，再次2 000 r/min離心5 min，逐滴加入體積分數為0.70冰乙醇，邊加邊震蕩，使細胞充分分散，將樣品放入-4 ℃冰箱保存。取出固定的細胞，2 000 r/min離心5 min棄上清液，加預冷的PBS 3 mL充分洗滌沉淀在底部的細胞，制成單細胞懸液，用400目的篩網過濾。2 000 r/min離心5 min，棄上清液。每管加入1 mL碘化丙啶染液染色，充分混勻，4 ℃避光保存30 min。采用流式細胞儀檢測紅色熒光，然后采用細胞分析軟件進行細胞DNA含量分析。實驗重復3次。

1.2.5細胞周期檢測 取對數生長期細胞，接種于6孔板中，待細胞過夜，將細胞分為空白組(A組)、加藥組(B組)、單純放療組(C組)以及放療和加藥組(D組)，D組以及B組加入姜黃素使其濃度為10 μmol/L，A、C組加同等體積雙蒸水，繼續培養24 h，將C、D組給予4 Gy放射線照射，離心，用預冷PBS洗滌沉淀3次，加入體積分數0.70冰乙醇于4 ℃過夜。再次離心，于沉淀細胞中加入約1 mL預冷的PBS重懸細胞。每組細胞分為3管，每管加入0.5 mL碘化丙啶染色液，輕柔吹打細胞沉淀至單細胞懸液，4 ℃避光存放30 min。用流式細胞儀檢測紅色熒光，然后采用細胞分析軟件進行細胞DNA含量及細胞周期分析。實驗重復3次。

2 結 果

2.1 不同濃度姜黃素對食管癌Eca-109細胞增殖抑制作用

實驗結果表明，相同時間下不同藥物濃度對細胞生長抑制率差異有顯著性；不同時間下對生長抑制率差異有顯著性(F=280.21、5.53，P<0.05)。見表1。選擇IC10濃度為測定細胞放療增敏的實驗濃度[9]，即選取10 μmol/L姜黃素作用細胞24 h。

2.2 姜黃素對食管癌Eca-109的放射增敏比

使用姜黃素預處理過的Eca-109細胞的SF明顯低于對照組(F=3.55，P<0.05)。結果見表2。采用GraphPad Prism 5.0軟件，用單靶多擊模型SF=1-(1-еxp-Dq/D0)N，擬合生存曲線，如圖1所示，計算得到N、D0、Dq、SF2、SER。見表3。

表1 姜黃素對Eca-109細胞的增殖抑制作用比較

表2 不同照射劑量對兩組Eca-109細胞SF的影響

2.3 姜黃素對Eca-109細胞凋亡的影響

姜黃素作用Eca-109細胞后接受放射與單純放射相比，細胞凋亡率差異具有顯著性(F=4.429，P<0.05)。實驗組隨著放射劑量的增加，凋亡率差異有顯著性(F=31.198，P<0.05)。見表4。

表4 兩組Eca-109細胞凋亡率比較

2.4 姜黃素對食管癌Eca-109細胞周期的影響

單純姜黃素處理可將Eca-109細胞周期阻滯于G2/M期，單純放療也可阻滯細胞周期于G2/M期，放療與姜黃素雙重作用可使更多細胞阻滯于G2/M期，差異有顯著性(F=6.786，P<0.05)。見表5。

分組G0/G1SG2/MA組53.23±0.2639.05±0.257.72±0.18B組46.24±0.0734.52±0.2919.24±0.32C組39.72±0.4329.61±0.3530.67±0.42D組12.04±0.1421.71±0.3866.25±0.24

3 討 論

放療增敏劑是一種化學或藥物制劑，當與放射同時應用時可以提高射線對生物體的殺傷效應。本實驗根據放療增敏劑量的選擇原則[9]，選取對細胞生長抑制率低的低劑量濃度作為姜黃素對Eca-109細胞的放療增敏濃度。

劑量存活曲線反映的是照射劑量與細胞凋亡率之間的關系，是分析受照射細胞群體輻射效應的一種模式[10]。劑量存活曲線的直線部分斜率的倒數為D0值，為細胞的平均致死劑量。D0值代表細胞放射敏感性的高低。Dq是準閾劑量，為克服肩區所需的劑量，代表細胞亞致死性損傷修復的能力。細胞接受照射后受到亞致死性損傷，并不造成死亡，經過一定時間，細胞所受損傷可被修復，稱為亞致死性損傷修復。SF2為離體腫瘤細胞經受2 Gy照射后的SF，代表腫瘤細胞內在放射敏感性[11]。D0、Dq、SF2值越小，細胞放射敏感性越高，細胞修復亞致死性損傷的能力越小，細胞內在放射敏感性越高。本實驗中經過姜黃素處理的Eca-109細胞較單純放療組D0、Dq、SF2值增大，SER為1.37，表明經姜黃素處理的Eca-109細胞與對照組相比，放射敏感性高。

放療敏感性與凋亡有密切關系[12]。許多機制可激活細胞凋亡，有研究表明某些凋亡通路與放療敏感性相關。研究顯示，經姜黃素處理后的宮頸癌HeLa細胞Bax蛋白的表達漸增，Bcl-2/Bax比值下降[13]。姜黃素可以增加促凋亡基因p53在G2細胞期的表達，并促使其凋亡[14]。JNK通路也與放療敏感及細胞凋亡有關[15-16]。在本實驗中，姜黃素和放射線的聯合作用對食管癌Eca-109細胞系有明顯促凋亡作用，伴隨放射劑量的增加細胞凋亡比例明顯增高。改變細胞凋亡水平可能增加放療的敏感性。

細胞周期有4個階段，包括G1、S、G2、M期，其中G2、M期對放療敏感性最高，G1期次之，對放療敏感性最差的是G0、S期。使腫瘤細胞停留在G2和M期是增強放療敏感性的一個重要途徑。研究發現，姜黃素可使鼻咽癌細胞G1期增加、G2/M期阻滯，從而增加放療敏感性[17]。喉癌Hep-2細胞系細胞周期G2/M期阻滯也可增加放療增敏性[18]。姜黃素組和射線的聯合應用比放射線的單獨應用增大了宮頸癌細胞的凋亡率，且處于G0/G1期的細胞明顯減少，細胞周期阻滯于G2/M期[19-20]。本實驗中，姜黃素將食管癌Eca-109細胞系阻滯于G2/M期，增加了其放射增敏性。

總之，姜黃素對人食管癌Eca-109細胞系有增殖抑制作用，并與時間和劑量有關，并且可以增加Eca-109細胞系的SER，增加其細胞凋亡，阻滯其細胞周期。本實驗為下一步探討姜黃素對人食管癌Eca-109細胞放射增敏的具體機制提供了依據。

[參考文獻]

[1] 陳萬青,張思維,曾紅梅,等. 中國2010年惡性腫瘤發病與死亡[J]. 中國腫瘤, 2014,23(1):1-10.

[2] 董國華,許飚,姚圣,等. 食管癌放療后手術切除116例臨床分析[J]. 醫學研究生學報, 2013,26(9):948-951.

[3] PUTERI B, NAZILAH S, SHAIK F K, et al. Curcumin improves the efficacy of cisplatin by targeting cancer stem-like cells through p21 and cyclin D1-mediated tumour cell inhibition in non-small cell lung cancer cell lines[J]. Oncol Rep, 2016,35(1):13-25.

[4] 高文,何彥津,梁鳳鳴. 姜黃素抗腫瘤血管生成分子機制研究進展[J]. 國際眼科雜志, 2016,16(3):466-468.

[5] 李軍,熊琨,龔元,等. 基于信號轉導通路的姜黃素抗氧化機制研究進展[J]. 中草藥, 2016,47(13):2373-2380.

[6] 李強,趙曙光,王旭霞,等. 姜黃素激活轉錄因子Nrf2對人肝細胞氧化應激的影響[J]. 胃腸病學和肝病學雜志, 2010,19(2):154-156.

[7] BIMONTE S, BARBIERI A, LEONGITO M, et al. Curcumin anticancer studies in pancreatic cancer[J]. Nutrients, 2016,8(7):433.

[8] 涂燕華,孫連娜. 姜黃素與類風濕性關節炎的相關實驗研究進展[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2012,18(19):310-314.

[9] 魏偉,吳希美,李元建. 藥理實驗方法學[M]. 北京:人民衛生出版社, 2010:976-978.

[10] 朱廣迎. 放射腫瘤學[M]. 北京:科學技術文獻出版社, 2005:98-139.

[11] 江浩. 腫瘤細胞SF-2的放射生物學意義及臨床價值[J]. 實用癌癥雜志, 2002,17(5):558-560.

[12] TOFILON P J, CAMPHAUSEN K. Molecular targets for tumor radiosensitization[J]. Chem Rev, 2009,109(7):2974-2988.

[13] SINGH M, SINGH N. Molecular mechanism of curcumin induced cytotoxicity in human cervical carcinoma cells[J]. Mol Cell Biochem, 2009,325(2):107-119.

[14] CHOUDHURI T, PAL S, DAS T, et al. Curcumin selectively induces apoptosis in deregulated cyclin D1-expressed cells at G2phase of cell cycle in a p53-dependent manner[J]. J Biol Chem, 2005,280(20):20059.

[15] 侯炳旭,馮麗英. JNK信號通路介導的凋亡在疾病中的作用[J]. 世界華人消化雜志, 2011(17):1819-1825.

[16] SUI X, KONG N, YE L, et al. P38 and JNK MAPK pathways control the balance of apoptosis and autophagy in response to chemotherapeutic agents[J]. Cancer Lett, 2014,344(2):174-179.

[17] WANG J, CHANG L, LAI X, et al. Tetrandrine enhances radiosensitivity through the CDC25C/CDK1/cyclin B1 pathway in nasopharyngeal carcinoma cells[J]. Cell Cycle, 2017(1):33.

[18] 梁慧玲,何曉琴,甘園園,等. SHIP2在放射線處理后喉癌Hep-2細胞中的增殖、凋亡及細胞周期中作用[J]. 中國醫藥導報, 2017,14(36):4-8,20.

[19] 沈方方,李銀萍. CYP 2J2和MMP-9在宮頸癌組織中的表達及其臨床意義[J]. 武漢大學學報(醫學版), 2014,35(1):81-84.

[20] 張莉,鄧守恒,李芳,等. 姜黃素體外同步放療對宮頸癌細胞增殖影響的實驗研究[J]. 山西醫藥雜志(下半月刊), 2013,42(4):369-371.