鈣結(jié)合蛋白S100A1對卵巢癌細(xì)胞A2780增殖和遷移的影響

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 青島 266003)

卵巢癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率居第三位，但死亡率位居第一。卵巢癌發(fā)病隱匿，早期不易發(fā)現(xiàn)，就診時卵巢癌患者中大多數(shù)都處于病變晚期，即使積極治療預(yù)后仍然不良。因此，深入探索卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機制對于卵巢癌的診斷和治療有著重要的意義。S100家族是EF-手型鈣結(jié)合蛋白家族中最大的亞家族，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。S100A1作為其中一員，在多種腫瘤中異常表達(dá)，但是在卵巢癌中的作用機制仍然不清。因此，本課題以卵巢癌細(xì)胞A2780作為研究對象，探討S100A1對卵巢癌細(xì)胞增殖及遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑

293T細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞A2780獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，由婦產(chǎn)科實驗室惠存；針對S100A1的shRNA為課題組前期構(gòu)建；質(zhì)粒PLP1、PLP2和VSVG由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院劉芝華教授惠贈；RPMI 1640培養(yǎng)基以及嘌呤霉素(美國GIBCO公司)；胎牛血清以及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國ABI公司)；實時定量PCR試劑盒(日本Takara公司)；Western blot試劑(美國Pierce公司)；β-Actin抗體和二抗IgG(美國Sigma公司)；CCK-8試劑盒(日本Dojindo公司)；Transwell小室購買自美國Costar Cambridge公司；單克隆鼠抗S100A1抗體購買自美國Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將293T細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞A2780置于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中，每1～2天換液一次，對數(shù)生長周期傳代，細(xì)胞貼壁生長，待細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)基底壁85%的表面時收集細(xì)胞，用于后續(xù)實驗。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

本研究將空質(zhì)粒pLVX-IRES-Neo以及帶有S100A1反向序列目的基因的質(zhì)粒pLVX-IRES-Neo-shS100A1分別與質(zhì)粒PLP1、PLP2以及VSVG共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，實驗轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格地按照Lipofectamine 2000說明書進行。收集病毒上清液，將重組慢病毒感染卵巢癌細(xì)胞A2780用嘌呤霉素篩選細(xì)胞2周以獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，分別獲得對照組細(xì)胞株(對照組)和實驗組細(xì)胞株(實驗組)。靶向S100A1的shRNA的序列為:5′-GATCCGTGGACTTCCAGGAGTATGTGCTTCCTGTC-AGACACATACTCCTGGAAGTCCACTTTTTG-3′。

1.4 實時定量PCR檢測S100A1 mRNA水平

提取實驗組以及對照組的A2780細(xì)胞的總RNA，后采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。將SYBR Green染料10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、dNTP 1 μL、Taq聚合酶2 μL、待測cDNA 5 μL、ddH2O 30 μL配置成總體積50 μL的實時定量PCR反應(yīng)體系。PCR的反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；然后93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共進行40個循環(huán)；最后以72 ℃延伸7 min。引物序列如下：S100A1-F：5′-CCGCTCGAGAGCAGCCACATTTGCAACCT-3′；S100A1-R:5′-CGCGGAT-CCGCTGGTGAGAGA-3′；β-action-F:5′-GGCGG-CACCACCATGTACCCT-3′；β-action-R:5′-AGG-GGCCGGACTCGTCATACT-3′。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測S100A1蛋白質(zhì)表達(dá)水平

將實驗組及對照組的A2780細(xì)胞裂解后提取總蛋白，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10的SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，用含體積分?jǐn)?shù)0.05的胎牛血清封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的一抗，在4 ℃下孵育過夜，洗膜，加入1∶5 000稀釋的二抗，在室溫下反應(yīng)1 h，洗膜。β-action以相同方法進行實驗并作為內(nèi)參照。采用增強型化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測S100A1蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

1.6 CCK-8實驗檢測細(xì)胞增殖能力

將實驗組及對照組A2780細(xì)胞以3×107個/L接種于96孔板中，每組設(shè)5孔平行對照。分別培養(yǎng)24、48、72 h后向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，室溫下繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞1 h，用分光光度法測定波長450 nm處各孔的吸光度(A)值，實驗重復(fù)3次，取均值。

1.7 Transwell小室實驗檢測細(xì)胞遷移能力

將實驗組及對照組的A2780細(xì)胞用0.25 g/L的胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，將1.5×104個細(xì)胞接種于含無血培養(yǎng)基200 mL的Transwell小室中，此為上室，下室加入含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的培養(yǎng)基500 mL，培養(yǎng)24 h后用濕棉簽擦去微孔膜上層未穿透小室的細(xì)胞，風(fēng)干后用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.20的甲醇固定，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.03的結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下計數(shù)隨機選取的5個視野中的穿膜細(xì)胞數(shù)，實驗重復(fù)3次，取均值。

1.8 劃痕愈合實驗檢測細(xì)胞遷移能力

將實驗組及對照組的A2780細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)過夜，至細(xì)胞融合至單層狀態(tài)時，用相同寬度的無菌吸頭做“+”字劃痕，用PBS反復(fù)沖洗孔板去除細(xì)胞碎片，更換含體積分?jǐn)?shù)0.10的胎牛血清培養(yǎng)基，立即記錄劃痕寬度并拍照，室溫下繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，48 h后在相同的位置記錄劃痕寬度并拍照對比劃痕愈合情況。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定表達(dá)敲降S100A1的A2780細(xì)胞株的構(gòu)建與鑒定

實時定量PCR檢測結(jié)果顯示，對照組與實驗組的S100A1 mRNA表達(dá)水平分別為1.000±0.001、0.654±0.007，與對照組相比較，實驗組A2780細(xì)胞中S100A1 mRNA的水平顯著下降(t=83.898，P<0.05)。蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，實驗組A2780細(xì)胞中S100A1蛋白質(zhì)表達(dá)水平較對照組下降。見圖1。結(jié)果顯示，成功建立了敲降S100A1的A2780細(xì)胞株，可用于后續(xù)研究。

圖1 兩組A2780細(xì)胞中S100A1 mRNA蛋白表達(dá)水平比較

2.2 敲降S100A1對A2780細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8實驗檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組A2780細(xì)胞在第48、72小時的細(xì)胞增殖能力明顯下降,差異具有顯著意義(t=4.975、7.393，P<0.05)。見表1。

2.3 敲降S100A1對A2780細(xì)胞遷移能力的影響

Transwell小室實驗結(jié)果顯示，對照組以及實驗組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為274.750±21.093、185.750±39.373，實驗組A2780細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)顯著小于對照組(t=3.985，P<0.05)。劃痕愈合實驗檢測結(jié)果提示，敲降S100A1的A2780細(xì)胞在48 h后的劃痕愈合能力較對照組減弱。見圖2。

表1 各組細(xì)胞增殖能力的變化

①、③為對照組，②、④為實驗組，HE染色，100倍。

3 討 論

卵巢癌是全球女性癌癥的相關(guān)死亡的第5大原因[1]，每年預(yù)計有22 000多新發(fā)病例，5年生存率低于30%[2]。缺乏早期診斷是卵巢癌病人預(yù)后不良的主要原因。關(guān)于卵巢癌的發(fā)病原理及分子機制目前仍不明確。

S100A1是S100蛋白家族中的一員，定位于人染色體1q21，作為多功能信號因子參與不同細(xì)胞生物過程的調(diào)控[3]。與大多數(shù)的S100家族成員一樣，S100A1通過與鈣離子結(jié)合而發(fā)生自身構(gòu)象改變，從而結(jié)合相應(yīng)靶蛋白發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)[4]。目前已知S100A1的靶蛋白有：Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，細(xì)胞骨架和絲連蛋白(如微管蛋白、F-肌動蛋白、中間絲)，神經(jīng)遞質(zhì)釋放相關(guān)蛋白(如突觸蛋白Ⅰ、Ⅱ)，轉(zhuǎn)錄因子(如p53)，酶以及其他的Ca2+激活蛋白(如S100B、S100A4、S1001P)等[5-7]。S100A1與不同靶蛋白結(jié)合后可參與肌肉收縮、細(xì)胞代謝以及腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲以及遷移等多種生物過程[8-9]。S100A1與人體多種疾病有關(guān)，如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝綜合征、心力衰竭衰等[10-12]。WRIGHT等[13]研究顯示，S100A1過表達(dá)可促進神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿茲海默癥的病理進展；EBRAHIMI等[14]研究顯示，S100A1與脂肪的生成以及肥胖的發(fā)展等有關(guān)；DU等[15]的研究顯示，S100A1可調(diào)控心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)運，心力衰竭時S100A1表達(dá)減少，并通過實驗證明敲降S100A1的心肌細(xì)胞凋亡增加、心力衰竭進程加快、心肌梗死后心力衰竭的發(fā)生率升高。ERYILMAZ等[16]研究顯示，S100A1可作為評估某些癌癥化療心臟毒性的潛在標(biāo)志物。

S100A1與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[17]。據(jù)報道，S100A1在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，如腎癌、乳腺癌、黑色素瘤等[3]。但也有研究顯示，S100A1在某些腫瘤如口腔癌、膀胱癌中表達(dá)下降[18-20]。研究顯示，S100A1在不同亞型的腎臟腫瘤中表達(dá)不一，可用于鑒別腎嫌色細(xì)胞癌、腎嗜酸細(xì)胞乳頭狀癌與腎嗜酸細(xì)胞腺瘤[21-22]。目前關(guān)于S100A1與卵巢癌的研究較少。DERYCKE等[23]研究結(jié)果顯示，在卵巢漿液性囊腺癌中S100A1的陽性率及表達(dá)程度高于其他病理類型，且S100A1的表達(dá)程度隨著卵巢癌Silverberg分級的增加而增加，該研究還發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜癌及宮內(nèi)膜樣卵巢癌中S100A1陽性病人的無復(fù)發(fā)生存率下降，說明S100A1可能與卵巢癌的病理類型、腫瘤分級及預(yù)后有關(guān)。此外，雖然S100A1在不同卵巢癌亞型中表達(dá)不一，但目前在臨床實踐中仍難以通過S100A1免疫組化標(biāo)記來區(qū)分卵巢癌的不同亞型[24-25]。本課題組在前期研究中證實，與正常卵巢組織相比，S100A1在卵巢癌組織中的表達(dá)明顯上調(diào)，可能在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。因此，本研究通過分子功能學(xué)實驗進一步對S100A1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的功能角色進行驗證。同時本研究成功建立了敲降S100A1的卵巢癌A2780細(xì)胞株，通過細(xì)胞增殖實驗及遷移實驗證實了敲降S100A1后的卵巢癌A2780細(xì)胞增殖及遷移能力明顯減弱，證明了S100A1在調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移中起重要作用，與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。S100A1在卵巢癌中的作用機制仍不清楚，S100A1過表達(dá)促進卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移可能與NF-κB信號傳導(dǎo)途徑的激活有關(guān)[20]，但具體分子機制有待進一步研究。

綜上所述，鈣結(jié)合蛋白S100A1可能通過促進卵巢癌細(xì)胞的增殖能力及遷移運動能力，進而促進卵巢癌的發(fā)展與轉(zhuǎn)移。S100A1有望成為監(jiān)測卵巢癌的有力標(biāo)志物以及可能的治療靶點，值得進一步研究。

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