抑制MET對RAS突變型結腸癌細胞的抗腫瘤作用

宋娜 白茗 王凱 李艷榮 曲秀娟 劉云鵬

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，其發病率和死亡率在我國呈上升趨勢。對于晚期結腸癌患者來說，化療聯合靶向治療是標準治療。在結腸癌的靶向藥物中，單克隆抗體主要包括抗EGFR單克隆抗體（西妥昔單抗和帕尼單抗）和抗VEGF單克隆抗體（貝伐珠單抗），而小分子抑制劑只有多靶點抑制劑瑞戈非尼一種，其靶點包括VEGFR1-3、TIE2、KIT、RET、RAF1、BRAF、PDGFR 和FGFR等［1］。靶向藥物因為靶點明確具有針對性的抗腫瘤作用，且口服方便，但因為存在腫瘤異質性容易出現耐藥。除了已經研制的靶點，還有很多重要的癌基因參與了結腸癌的發生發展。因此，探索結腸癌更有效的治療靶點具有重要的臨床價值。

在眾多的候選靶點中，跨膜酪氨酸激酶受體（receptor tyrosine kinase，RTKs）參與了多種腫瘤的發生發展，在腫瘤預后和藥物耐藥等方面發揮了重要作用。其中，MET受體酪氨酸激酶是近年來研究的熱點靶點，其配體是肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）。MET自身突變或過表達，或通過與配體結合使下游信號發生級聯反應，在調節細胞生長、細胞凋亡、細胞骨架形態結構，以及促進腫瘤細胞侵襲轉移發生等生物行為過程中發揮重要作用［2］。研究提示，在結直腸癌中，從正常的上皮細胞到腺瘤以及結直腸癌，MET表達水平是逐步升高的［3］。MET高表達與結直腸癌的預后差相關［4］，HGF/MET信號轉導通路的活性是結直腸癌肝轉移發生的關鍵因素［5-6］。另外，HGF/MET信號通路也參與了結腸癌抗EGFR單克隆抗體的耐藥［7-8］。在我們的前期研究中，發現西妥昔單抗誘導相對耐藥的細胞發生MET活化，并且證實了非配體依賴的MET磷酸化參與了結腸癌細胞對西妥昔單抗的耐藥［8］。目前，MET抑制劑在晚期非小細胞肺癌和晚期胃癌等實體腫瘤的臨床試驗中顯示了一定的療效［9-10］，因此MET抑制劑也極有可能用于結直腸的治療。

對于RAS突變的結腸癌易發生肝轉移且預后更差，相對的靶向治療選擇也更局限［11］。在晚期非小細胞肺癌的研究中提示，MET抑制劑tivantinib聯合厄洛替尼在KRAS突變的患者中療效更好［10］，所以本研究探索了抑制MET在RAS突變型結腸癌中的抗腫瘤作用。本研究選擇了4種常見的RAS突變型結腸癌細胞，應用siRNA敲除MET蛋白表達及常見MET抑制劑PHA-665752，在體內和體外實驗中觀察抑制MET對于RAS突變型結腸癌中的作用，為靶向MET治療提供更多的依據。

資料與方法

一、細胞和主要試劑

人 結 腸 癌 細 胞 HCT-116、DLD-1、Lovo和HCT-15均購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所，胎牛血清購自美國Gibco公司，RPMI 1640培養基購自美國Hyclone公司。細胞生長于含有10%滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 ug/mL鏈霉素的RPMI 1640培養液中，于37 ℃、5% CO2的培養箱內培養。PHA-665752 購自美國Selleck公司，HGF購自美國R&D公司，噻唑藍（MTT）購自美國Sigma公司。鼠抗人MET、兔抗人 phospho-MET、AKT、phospho-AKT、ERK1/2、Phospho-ERK1/2和Actin 抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。

二、MTT法檢測細胞增殖抑制

在96孔板中接種HCT-116（5 000個/孔）和Lovo（8 000個/孔），設3個復孔。第二日待細胞貼壁后加入不同濃度的PHA-665752或進行MET siRNA，培養 48 h 后加入 5 mg/mL MTT 20 μl，培養4 h后加25 ul DMSO，測定570 nm的OD 值。細胞存活率（%）=（實驗組OD 值－空白組OD值 ）/（對照組OD值－空白組OD值）×100%。實驗重復3次。

三、Western Blotting檢測蛋白表達

處理細胞后加入100 μl裂解液，超聲波破碎細胞，采用考馬斯亮藍方法進行蛋白定量后進行SDS-PAGE電泳。60 V恒壓至蛋白進入分離膠后改為120 V恒壓；采用60 V恒壓轉印3小時，5%脫脂牛奶封閉1小時后封閉一抗，4 ℃搖晃過夜。第二日，TBST 漂洗3次后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，漂洗后應用增強化學發光法顯像。

四、SiRNA轉染敲除MET蛋白表達

在6孔板中接種HCT-116和Lovo，待細胞貼壁后，應用不含血清和抗生素的RPMI 1640培養液分別和Control siRNA/MET siRNA（5′-GCCUGAAUGAUGACAUUCU-3′）及陽離子脂質載體LipofectamineTM2000配置混合液，最后將兩部分混合室溫放置20分鐘，加入含有1.5 mL不含血清和抗生素的RPMI 1640培養液的6孔板中，作用48小時后收取蛋白樣品。

五、細胞克隆形成檢測PHA-665752對細胞克隆形成的抑制作用

在12孔板中接種300個/孔HCT-116，待細胞貼壁后加入不同濃度的PHA-665752，14天后應用PBS清洗，晾干后用Giemsa染色。

六、HCT-116細胞裸鼠移植瘤的成瘤實驗

8只3周齡裸鼠飼養一周后，每只皮下接種HCT-116細胞2×106個/200 μl。待瘤體積長到50 mm3［瘤體積=（腫瘤長徑×腫瘤短徑2）/2］后隨機分為兩組，一組隔日給予PHA-665752 30 mg/Kg（溶于10%聚乙二醇中）腹腔注射，一組給予等量10%聚乙二醇注射，2～3天測量小鼠體重及腫瘤大小，至第4周處死裸鼠，測量腫瘤長徑和短徑，稱量移植瘤重量。

七、統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析。兩組之間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、RAS突變結腸癌細胞系的MET蛋白表達

選擇4種RAS突變的結腸癌細胞系，包括 HCT-116、DLD-1、Lovo和 HCT-15，Western Blotting檢測MET蛋白情況。結果顯示四種RAS突變結腸癌細胞均表達MET蛋白（圖1）。

二、siRNA敲除MET蛋白表達對RAS突變結腸癌細胞的增殖抑制作用

選擇HCT-116和Lovo細胞，應用siRNA敲除MET蛋白，Western Blotting驗證了敲除效率，MTT檢測了敲除MET蛋白后對細胞增殖的抑制作用。HCT-116和Lovo細胞下調MET蛋白表達后細胞存活率分別變為80.4±4.5%和72.2±5.8%（圖2）。

三、MET抑制劑PHA-665752對RAS突變結腸癌細胞的增殖抑制作用

選擇HCT-116和Lovo細胞，應用不同濃度的MET抑制劑PHA-665752作用48小時，MTT檢測PHA-665752對兩種細胞的增殖抑制作用，發現PHA-665752對結腸癌細胞的增殖抑制作用呈明顯的劑量依賴性。另外，應用細胞克隆形成實驗檢測PHA-665752對細胞克隆形成能力的影響，結果顯示5μM PHA-665752作用HCT-116細胞的細胞克隆形成數目同對照組相比只有18±8%（圖3）。

四、MET抑制劑PHA-665752對HCT-116細胞移植瘤的成瘤作用影響

為了進一步驗證MET抑制劑PHA-665752對RAS突變的結腸癌細胞的體內作用，選擇HCT-116建立裸鼠皮下移植瘤，給予腹腔注射PHA-665752觀察皮下移植瘤成瘤大小。結果顯示 PHA-665752可明顯抑制HCT-116細胞的皮下移植瘤大小，用藥第4周的腫瘤體積為300±72 mm3，對照組為608±59 mm3（t=5.731，P=0.005）（圖4）。

五、MET抑制劑PHA-665752對增殖信號通路的影響

應用PHA-665752預處理細胞2 h后加入HGF刺激MET信號通路活化，Western Blotting檢測MET通路主要蛋白及磷酸化表達。結果顯示HGF能明顯激活p-MET及下游p-AKT和p-ERK，而應用PHA-665752預處理能明顯抑制HGF激活的p-MET、p-AKT和p-ERK， 提 示PHA-665752對MET/AKT/ERK信號通路有抑制作用（圖5）。

討 論

HGF/MET信號通路在多種腫瘤的增殖、存活、血管形成和侵襲轉移等方面發揮了關鍵性的作用。另外，MET異常表達及活化會介導靶向藥物耐藥，導致治療失敗［12］。MET通路活化后不僅會發生下游信號的級聯反應，還會與其它跨膜RTKs發生串話，增強其發揮的生物學行為［13-14］。因此，在MET異常表達的腫瘤中靶向MET治療可能成為有前景的抗腫瘤療法。

圖1 4種RAS突變型結腸癌細胞系的MET蛋白表達量 圖2 應用siRNA敲除MET蛋白表達對細胞增殖的影響。2A：在HCT-116和Lovo細胞中應用siRNA敲除MET蛋白表達，Western Blotting檢測MET蛋白表達；2B：MTT法檢測siRNA敲除MET蛋白后對細胞增殖的作用 圖3 MET抑制劑PHA-665752對細胞增殖的影響。3A：在HCT-116和Lovo細胞中應用不同濃度PHA-665752作用48小時，MTT檢測細胞存活；3B：在HCT-116應用不同濃度PHA-665752作用14天，染色后計數細胞克隆數目 圖4 MET抑制劑PHA-665752對HCT-116裸鼠移植瘤的作用 圖5 MET抑制劑PHA-665752對MET/AKT/ERK信號通路的作用。在Lovo細胞中應用PHA-665752預處理2小時后加入HGF，Western Blotting檢測p-MET、p-AKT和p-ERK及本底的蛋白表達

近幾年，臨床上研發了多種MET抑制劑并開展了臨床試驗。其中比較成功的是克唑替尼（Crizotinib），它是靶向MET、ALK融合基因和ROS1的多靶點受體酪氨酸激酶，目前被批準用于EML4-ALK融合的肺腺癌患者，同時可用于MET基因擴增的肺癌患者［15］。另一種MET抑制劑（Tivantinib）聯合厄洛替尼治療二線以后非小細胞肺癌的Ⅲ期研究中，同對照組單藥厄洛替尼相比，只延長了無進展生存時間（3.6個月 vs 1.9個月，P＜0.001），并未提高總生存（8.5個月 vs 7.8個月，P=0.81）［16］。在結直腸癌的治療中，開展了Tivantinib聯合伊立替康和西妥昔單抗二線治療KRAS野生型患者的Ⅱ期研究，對入組的117例患者進行分析，加入Tivantinib并未延長無進展生存時間（8.3個月 vs 7.3個月，P=0.38），亞組分析顯示在免疫組化檢測MET高表達PTEN低表達的患者中，Tivantinib有更好的療效，但是由于患者例數較少不能得到明確結論［17］。本研究選擇RAS突變結腸癌細胞，因為RAS突變的結腸癌患者預后更差，易發生肝轉移，且靶向治療有限，亟待研發新的有效靶點。在常見的四種RAS突變結腸癌細胞系中，均有MET蛋白表達。應用siRNA敲除MET蛋白表達對RAS突變結腸癌細胞的增殖抑制作用可達19.6～27.8%，而應用MET特異性抑制劑PHA-665752對兩種細胞的增殖抑制作用呈劑量依賴性，同時細胞克隆形成實驗驗證PHA-665752可有效抑制長時間的細胞克隆形成。除了體外實驗，本研究應用HCT-116細胞構建裸鼠皮下成瘤模型，給予PHA-665752單藥腹腔注射，驗證了PHA-665752可明顯抑制HCT-116細胞的皮下移植瘤大小。在作用機制方面，應用MET的特異性配體HGF進行誘導刺激，證明了MET抑制劑可有效抑制MET/AKT/ERK信號通路，從而發揮腫瘤抑制作用。

本研究從體內體外實驗均證實了抑制MET對RAS突變型結腸癌細胞的增殖抑制作用，為靶向MET治療RAS突變型結腸癌患者提供了理論依據。目前關于抑制MET治療惡性腫瘤患者的臨床研究提示，并不是所有的患者對MET抑制劑有效，有限的結果提示MET基因擴增或者MET蛋白高表達的患者可能對抗MET治療更有效，因此篩選出靶向MET治療的優勢人群是下一步的研究方向。

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