液相色譜串聯質譜法測定動物源性食品中喹乙醇代謝物殘留量的不確定度分析

羅媛媛，萬偉杰，胡麗芳

(江西省農業科學院 農產品質量安全重點實驗室/江西省農業科學院 農產品質量安全與標準研究所，江西 南昌 330200)

喹乙醇(Olaquindox)又名喹酰胺醇，是一種具有促生長和廣譜抗菌作用的飼料添加劑[1]。喹乙醇的性質不穩定，在動物體內會迅速代謝，其中3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)是代謝最主要的產物之一，被認定為指示殘留標識物。目前，測定喹乙醇代謝物的方法主要有膠體金免疫層析法[4]、液相色譜法[5-8]和液相色譜串聯質譜法[9-13]，而有關喹乙醇代謝物測定的不確定度評定只有一篇水產品的文獻[14]，未見飼料中喹乙醇代謝物測定的不確定度評定研究。

2016年5月31日發布的正式版《檢驗檢測機構資質認定評審準則》要求檢驗檢測機構要建立和保持應用評定測量不確定度的程序。測量不確定度能對檢測數據進行客觀真實的評價，給出測量結果的可信程度[15]。本文通過對SN/T 0197─2014《出口動物源性食品中喹乙醇代謝物殘留量的測定 液相色譜-質譜/質譜法》[16]進行動物源性食品中喹乙醇代謝物殘留檢測的不確定度評定，希望為實驗室質量控制(如產品質量臨界值時的判定)提供可靠依據，同時為檢測其他產品中喹乙醇代謝物殘留量的不確定度提供參考，評定方法參照JJF 1135─2005《化學分析測量不確定度評定》[17]和JJF 1059.1─2012《測量不確定度評定與表示》[18]。

1 實驗部分

1.1 試劑和材料

標準品:3-甲基喹噁啉-2-羧酸，氘代3-甲基喹噁啉-2-羧酸甲酯(MQCA_D7)(Sigma公司),純度為(99.00±0.02)%；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純；其他為分析純。

1.2 主要儀器和設備

液相色譜-質譜/質譜儀(配有電噴霧離子源)Agilent1290-6460 triple quad；氮吹儀(英國PEAK畢克氣體氮吹儀)；日本日立CR22G Ⅲ型高速冷凍離心機；電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；旋渦混合器MJ-U007；美國色譜科真空固相萃取裝置；pH計(瑞士Mettler Toledo公司)；均質器:轉速大于10000 r/min。

1.3 測試過程

1.3.1 前處理方法 稱取5.00 g樣品于50 mL離心管中，加入8 mL蛋白復合體溶液，混勻后加入0.3 mL 0.01 g/mL溶液混勻，放置于空氣浴搖床中(47±3) ℃酶解16 h。酶解后的樣品溶液放至常溫，加入20 mL 0.3 moL/L鹽酸溶液，混勻后15000 r/min離心5 min，吸取上清液加入10 mL正己烷渦旋混勻，5000 r/min離心5 min，棄去上層液保留下層液，下層液移入混合型陰離子交換固相萃取柱中，全部樣液流出后用10 mL乙酸鈉甲醇溶液淋洗，溶液全部流出后抽干。依次用6 mL水﹑6 mL 1 mmoL/L氨水-甲醇(v/v=4∶1)溶液和6 mL甲醇淋洗，抽干，最后用3 mL 2%甲酸乙酸乙酯洗脫液(接液)，加入100L內標，濃縮至干。加入1.00 mL 0.1%甲酸-甲醇(v/v=9∶1)溶液溶解殘渣供液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.3.2 標準溶液配制標準儲備溶液 標準儲備溶液:準確稱取標準品適量用甲醇定容，并配制為濃度為1.0 mg/mL的標準儲備溶液，于-20 ℃冰箱保存。

標準中間液:用1 mL單標線吸量管吸取儲備液1 mL，用甲醇溶解，并定容至10 mL，濃度為100g/mL。

標準工作溶液:根據需要逐級稀釋標準中間，配制成濃度為20.0 ng/mL標準工作溶液，現用現配。

內標儲備液:稱取內標標準品，用甲醇溶解，并配制成濃度約為100 mg/L的內標儲備液，于-20 ℃冰箱保存。

內標工作液:根據需要逐級稀釋內標標準儲備溶液(4)，配制成濃度為0.1 mg/L的內標工作溶液，現用現配。

標準儲備溶液:準確稱取10.1 mg標準品，用甲醇溶解定容至10.0 mL，配制成濃度為1000 mg/L的標準儲備溶液，于-20 ℃冰箱保存。

標準中間液:用1 mL單標線吸量管吸取儲備液1 mL，用甲醇溶解并定容至10 mL，濃度為100g/mL。

標準工作溶液:根據需要逐級稀釋標準中間，配制成濃度為20.0 ng/mL標準工作溶液，現用現配。

基質提取液:空白樣品，除不加內標外，其他操作同1.3.1處理后得到的溶液。

基質標準工作液:分別吸取0、25、50、100、200、500L標準工作液，加入100L內標工作液，用樣品空白提取液定容至1.0 mL,分別配成0、0.5、1.0、2.0、4.0、10.0 ng/mL濃度系列基質標準工作溶液(表1)。

表1 標準工作液的配制

1.3.3 色譜條件 色譜柱:C18柱，2.6 μm,100 mm×3.0 mm(內徑)，或相當；流動相:A相0.1%甲酸水溶液、B相0.1%甲酸甲醇溶液，流速:0.2 mL/min;柱溫:40 ℃;進樣量:5L梯度洗脫條件見表2。

表2 5 μL梯度洗脫條件

1.3.4 質譜條件 離子化模式:電噴霧電離源正離子模式(ESI+);質譜掃描方式:多反應監測(MRM);毛細管電壓:3500 V；離子源溫度(TEM):325 ℃；干燥氣溫度:300 ℃；干燥氣流量:5 L/min；霧化氣壓力:400 psi；鞘氣溫度:400 ℃；鞘氣流量:12 L/min。其他參考質譜條件見表3。

表3 其他參考質譜條件

注:*為定量離子。

1.4 建立數學模型

其中，X:試樣中喹乙醇代謝物的含量(g/kg)；C:從標準曲線得到的喹乙醇代謝物的濃度(g/mL)；V:樣品最終定容體積(mL)；m:樣品質量(g)。

2 結果與分析

2.1 不確定度來源分析

從以上方法可以看出，樣品中喹乙醇代謝物測定結果不確定度的主要來源于待測物濃度、測量重復性、回收率、試樣稱量、試樣定容。

2.2 不確定度分量的評定

2.2.1 待測物濃度引入的不確定度 待測物濃度分為標樣的配制和標準曲線擬合2個部分。標準液的配制包括儲備液的配制、稀釋、標準曲線溶液的配制3個步驟。

(1)儲備液配制過程產生的不確定度u(C-1)

由儲備液配制所產生的相對標準不確定度:

(2)儲備液稀釋過程產生的相對標準不確定度urel(C-2)

儲備液稀釋過程見1.3.2，稀釋儲備液引入的不確定度見表4。

表4 儲備液稀釋過程中引入的不確定度

則稀釋儲備液引入的相對標準不確定度為:

(3)標準曲線配制過程產生的相對標準不確定度urel(C-3)

標準溶液配制過程見表1，配制標準系列工作液引入的不確定度見表5。

則配制標準系列溶液產生的相對標準不確定度：

(4)擬合標準工作曲線引入的相對標準不確定度urel(C-4)

分別取5種不同濃度的標準系列溶液重復測定3次，得到對應峰面積A的平均值，擬合成線性回歸方程為A=aC+b(a為截距，b為斜率)，結果見表6所示。取一陽性樣品，進行3次重復測定，得出平均質量濃度C0，其測定結果見表7。則由標準曲線擬合產生的不確定度計算過程如下:

表5 標準系列溶液配制過程引入的不確定度

表6 標準曲線測定結果和不確定度計算

則待測物濃度C引入的相對標準不確定度：

表7 陽性樣品檢測數據

表8 重復測定結果和不確定度計算

重復性引入的不確定度按下列公式計算:

則測量重復性產生的不確定度：

2.2.3 回收率產生的不確定度u(R) 在空白豬肉、牛肉、雞肉、魚肉試樣中各添加0.7g/kg的喹乙醇代謝物標準溶液，平行測定6次。回收率結果如表9所示。

表9 動物源性食品中喹乙醇代謝物加標回收率測定結果和不確定度計算

回收率引入的不確定度按下列公式計算:

則回收率產生的不確定度

2.2.5 待測液定容產生的不確定度u(V) 樣品經酶解、凈化、氮氣吹干后用分度吸量管移取1.0 mL流動相溶解殘物，則不確定度計算如下:

(2)溫差引入的不確定度:水的體積膨脹系數為2.10×10-4/℃，實驗室室溫在±3 ℃之間變動，根據均勻分布進行B類不確定度評定，則溫差引入的不確定度為:

2.3 合成不確定度

綜上所述，則加標動物源性食品樣品中喹乙醇代謝物測定結果合成不確定度計算如下:

=0.077

2.4 擴展不確定度及結果表示

3 結論

本文通過對標準溶液配制、樣品測量重復性、目標化合物回收率、樣品稱量、待測液定容等因素的考慮，發現按SN/T 0197─2014出口動物源性食品中喹乙醇代謝物殘留量的測定方法中，測量重復性和回收率所引入的不確定度最大，其次為標準曲線擬合，樣品稱量和待測液定容引起的不確定度可忽略不計。因此，在實際檢測中，可通過增加測定樣品平行樣和標準系列溶液的次數、保證儀器較高的靈敏度和穩定性、提高檢測人員的檢測技術來降低測量不確定度，從而使檢測結果更加準確可靠。

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