分批補料式高密度培養植物乳桿菌的研究

盧富山，尹清強，趙衛衛，王 瀟

(1.河南普愛飼料股份有限公司，河南 周口 466100；2.河南農業大學 牧醫工程學院，河南 鄭州 450002)

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)具備免疫調節、抑制病原微生物、維持腸道菌群平衡和促進營養物質吸收等很多保健作用[1]。植物乳桿菌微生態制劑的制備，關鍵技術就是高密度培養，限制乳酸菌增殖的關鍵因素是有機酸的積累和發酵底物的消耗。在發酵進入對數生長后期，乳酸以及其他有機酸的生成導致pH的下降，在pH降為4.0左右時，就會抑制乳酸菌的生長，這時對數生長期的細胞繁殖就會被破壞[2]；同時，底物的大量消耗也限制了微生物的持續增長。補料分批培養能夠有效中和過多的酸并補充缺失的營養素，在流加補料液的過程中，通過應用低濃度初糖并且在發酵過程中連續補料[3]和調整至最適pH值，使菌體數量在發酵結束時能夠獲得很大提高，對乳酸菌進行大規模培養具有一定的指導意義[4-5]。本研究對植物乳桿菌進行補料分批培養，找出培養過程中有效的限制性營養因子[6]和最優調整pH方式，以此獲得高密度細胞培養方法，解決植物乳桿菌發酵劑制備中的關鍵環節。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 植物乳酸桿菌(L.plantarum)CICC 20265，購買于中國工業微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養基 種子培養基(MRS)：葡萄糖2%、胰蛋白胨1%、牛肉蛋白胨1%、酵母浸粉0.5%、NaAc 0.5%、K2HPO40.2%、MgSO40.058%、MnSO40.025%、檸檬酸二胺0.2%、吐溫80為0.1 mL、pH為6.2～6.4。基礎發酵培養基：葡萄糖2.0%、胰蛋白胨1.4%、NaCl 0.25%、MgSO40.1%、K2HPO40.5%、NaAc 0.3%。

1.2 方法

1.2.1 種子液的制備 接種凍干保藏的菌種于種子培養基，于37 ℃靜止培養18 h。

1.2.2 發酵培養 將制備的種子液按照1%的接種量接種于發酵培養基，于37 ℃靜止培養18 h，即為后續試驗用發酵液。

1.2.3 分批補料式高密度培養[7]乳酸菌在37 ℃下培養至12 h進入對數生長末期，殘糖質量濃度在5 g/L左右。然后在對數生長期，采用不同的分批補料手段向發酵液中添加新鮮的補料液，同時添加堿液保持pH值為6.5。

首先在500 mL培養瓶中裝入200 mL發酵液，對乳酸菌進行補料分批培養研究，探討對數生長末期限制微生物生長的限制性底物，以活菌數為參照，研究補料時的最適中和劑和補料液的最佳碳氮比。

在發酵12 h后，向發酵液中分別加入不同配比的補料液，通過測定補料后活菌數的變化，研究限制微生物增殖的營養要素以及發酵培養基中的碳氮源最佳配比。將發酵培養基按照營養組分為2組：葡萄糖(L1,30 g/L)和蛋白胨(L2，28 g/L)。

在發酵12 h后，分別選擇1 mol/L的KOH、Na2CO3溶液、氨水和醋酸鈉為中和劑，調解pH到最適，最終通過測定活菌數選擇最佳的中和劑。

在確定補料液最佳碳氮比和最適中和劑后，進行10 L發酵罐擴大實驗，運用恒速流加、葡萄糖反饋流加等補料方式，將碳氮比為5∶7的補料液注入發酵罐并同時調整pH值，通過測定活菌數的變化，探究最佳分批補料方式。

1.2.4 活菌計數方法 將發酸液按10的倍數進行稀釋，取1 mL稀釋液涂布于的固體培養基上，在37 ℃下培養24 h，計算發酵液中活菌數(CFU/mL)，并用自然對數(lg)表示。

1.2.5 pH值的測定 采用PHS-3C精密酸度計直接測定發酵液的pH值。

1.2.6 還原糖的測定 采用DNS法。

2 結果與分析

2.1 初始葡萄糖濃度對植物乳桿菌生長的影響

由表1可知：葡萄糖質量濃度在5～15 g/L范圍內，菌體濃度隨初糖質量濃度增大而增加；當葡萄糖質量濃度為15 g/L時，菌體濃度最大；初始糖濃度繼續增加，菌體濃度降低。由此可以看出在一定范圍內，增加初始糖質量濃度可以促進細胞增殖，但過高的底物濃度反而抑制了細胞的增殖。

Combining the mathematical model defined by Eqs.(1)–(3),the transfer function of the hydraulic section is

2.2 起始氮源濃度對植物乳桿菌生長的影響

配制不同蛋白胨含量的培養基，含量分別為6、10、14、16、18 g/L，其他成分相同，裝液量100/250 mL，接種量3%，培養24 h后測活菌數。

表1 不同初糖濃度對活菌數的影響

由表2可以看出，14、16、18 g/L下的活菌數差異不明顯，但14 g/L下的活菌數最高，用量也較少，確定氮源初始濃度為14 g/L。

表2 不同氮源濃度對活菌數的影響

2.3 最適pH的確定

將液體培養基初始pH值分別調至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，37 ℃下恒溫培養18 h后，檢測其活菌數。由表3可以看出，發酵液初始pH為7.0～7.5時活菌數最高。

表3 不同初始pH對活菌數的影響

2.4 限制性底物的確定

補料分批培養首先要確定對數生長末期限制微生物增殖的營養因子。由圖1可知，在微生物生長進入穩定期時，菌體OD值達到0.2976，殘糖質量濃度降至2 g/L，表明葡萄糖的損耗可能是限制微生物繼續增殖的因素。

微生物的增殖需要多種營養因子，那么培養基到對數末期可能還存在其他限制性營養因子。因此本試驗設計了3種補料液，分別為補料液L1(10 mL)、補料液L2(10 mL)、補料液L1(5 mL)+ L2(5 mL)，在分批培養至對數生長末期(12 h)，將上述補料液分別一次性加入200 mL的發酵培養液，在補料培養階段調節pH值在7左右，培養22 h后結束發酵，測得其活菌數變化(表4)。

在發酵平穩期加入補料液L1，22 h后菌體濃度增加，這表明分批培養末期的細胞增殖停止是由碳源匱乏引起的。當補料液中含有氮源時(L2及L1+L2)，菌體總量有所增加，這表明氮源也是對數生長末期的限制性營養因子，需要在分批補料過程中加入補料液。

圖1 植物乳酸桿菌生長過程變化表4 不同補料類型對活菌數的影響

補料類型終pH活菌數/(CFU/mL)L14.719.18±0.012 BL27.048.79±0.13 CL1+L24.659.30±0.03 AB空白3.778.57±0.06 C

注：空白表示未進行補料。

2.5 補料液最適碳氮比的確定

在補料液中，葡萄糖(L1)添加量不變(5 mL)，增加蛋白胨的添加量。在前4組實驗中，隨著蛋白胨添加量的增加，活菌數也隨之提高，并且差異顯著。這主要是由于補料液中蛋白胨含量較少。當蛋白胨添加量(L2)增加到7 mL時，獲得了最大的活菌數；繼續增加蛋白胨則活菌數趨于穩定且差異不顯著，此時可能葡萄糖的缺乏又成為關鍵因素。所以在補料試驗中，確定補料液中的C/N(體積比)為5∶7。

表5 不同碳氮比的補料液對活菌數的影響

2.6 中和劑的選擇

在乳酸桿菌高密度培養過程中往往通過流加堿液來消除酸的反饋抑制[7]。本實驗選擇KOH、Na2CO3溶液、氨水和醋酸鈉為中和劑，按確定的適宜條件進行發酵，在對數生長末期一次性補料的同時選用不同的中和劑調節培養基pH值到7，并比較不同中和劑對植物乳桿菌高密度培養的影響，中和劑的濃度為1 mol/L，測定培養24 h后的活菌數。

在乳酸菌的靜止培養過程中，大量乳酸以及其它有機酸積累會對細胞的分裂增殖產生反饋抑制[8]。植物乳桿菌在高密度培養過程中會產生大量的有機酸，在培養過程中加入中和劑后，氫氧化鈉能快速恢復降低的pH值，醋酸鈉作為緩沖劑能穩定發酵液的pH值。綜上，試驗確定氫氧化鈉+醋酸鈉為最適中和劑(表6)。

表6 不同中和劑對活菌數的影響

2.7 最適補料方式的確定

首先應用恒速補料策略進行高密度培養，以2 g/(L·h)(以葡萄糖計) 的補料速度向發酵液中加入C/N為5∶7 (體積比)的補料液，同時每隔2 h調節一次pH值至7。

葡萄糖反饋補料策略：通過對補料液補料速度的調節來實施葡萄糖反饋補料控制，根據培養液內的葡萄糖濃度的變化及時調整葡萄糖添加量，使葡萄糖濃度維持在一個合適的范圍內。雖然確定殘糖的質量濃度需要1 h的間隔時間，但可以粗略地保持一個所需的低殘糖質量濃度(1.0～1.5 g/L)，在該條件下，培養24 h。

由圖2可知，葡萄糖反饋流加效果最好，活菌濃度能達到3.1×109CFU/mL；而恒速流加能達到2.4×109CFU/mL；兩種流加培養方式[9-10]的活菌數都高于靜止培養。葡萄糖反饋流加是將發酵過程中的葡萄糖濃度控制在一定范圍內，發酵液中碳氮源、pH值在最適水平，有利于微生物細胞的增殖；而恒速流加能夠在發酵前期提供給乳酸菌生長的營養要素，到對數生長期，微生物生長迅速，營養物質的消耗速度已經大于補料速度，后期則不能滿足菌體對營養物質的需求。因此，葡萄糖反饋流加方法更適合植物乳桿菌的高密度培養。

圖2 不同補料方式下活菌數的變化

3 討論

本研究首先確定了補料液的組分與配比，確定了最佳的中和劑組合模式。通過流加不同組分、不同配比的補料液，發現碳源(葡萄糖)和氮源(蛋白胨)是植物乳桿菌增殖的限制性底物，從而確定了葡萄糖和蛋白胨混合物為補料分批培養過程中需要補加的營養素，并在此基礎上確定了補料液的最優碳氮比5∶7。同時，乳酸菌在生長過程中不斷代謝糖類產生乳酸和其他有機酸，使得培養液酸度不斷增加，乳酸菌的生長受到低pH值的抑制，因此在補料同時向培養基中加入中和劑來調解pH值，使用緩沖劑來維持pH值在一定范圍內，最終選用氫氧化鈉和醋酸鈉組合為最優中和劑。

為了研究更好的補料分批高密度培養法，本研究比較了2種流加模式，恒速流加模式雖然能夠平穩地向培養液中補充營養要素，在前期一定程度上滿足了微生物的營養需求，但到了對數生長中后期細胞增殖迅速，恒速流加就無法滿足細胞增殖的營養需求，因此會限制菌體的快速生長。葡萄糖反饋補料被證實為最佳的，這種流加方式能將發酵液中葡萄糖控制在一定的范圍內，并且通過內部營養需求調整營養要素供給量，所以最終獲得了較高的細胞濃度，活菌數達到3.1×109CFU/mL，最終使用葡萄糖反饋流加可以使活菌數提高4倍。

參考文獻：

[1] 張敏,黃星原.病毒性心肌炎小鼠血清CAM21和TNF2-t的變化及意義[J].同濟大學學報:醫學版,2006,27(1):21-23.

[2] 金雙喜,韓羿斌.一株植物乳酸桿菌的高密度發酵[J].中國微生態學雜志,2008,20(4):365-366,368.

[3] 靳志強,李平蘭.補料分批法高密度培養德氏乳桿菌保加利亞亞種S-1[J].中國乳品工業,2007,35(1):4-9.

[4] Riesen B D, Guthke R. High cell density cultivation of microorganisms [J]. Appl Microbiol Biotecho1, 1999(51): 422-430.

[5] 任亞妮,車振明,黃莉.乳酸菌發酵劑中的細胞高密度培養條件及最佳離心條件探索[J].中國調味品,2011,36(5):36-39.

[6] Furie M B, Tancinco M C, Smith C W. Monoclonal antibodies to leukocyte integrins cd11a/cd18 and cd11b/cd18 or intercellular adhesion molecule-1 inhibit chemoattractant-stimulated neutrophil transendothelial migration in vitro[J]. Blood, 1991, 78(8): 2089-2097.

[7] 王海娟,韓雪,馬微,等.高滲條件下相容性溶質對乳酸桿菌的作用[J].食品科技,2015(3):16-19.

[8] 劉輝,季海峰,王四新,等.飼用乳酸菌高密度培養的研究進展[J].中國飼料,2016(4):11-14.

[9] 徐慶陽,馬雷,程立坤,等.葡萄糖流加方式對黃色短桿菌生產L-亮氨酸的影響[J].食品與發酵工業,2010(8):1-5.

[10] Beom S K, Seung C L, Sang Y L, et al. High cell density fed batch cultivation ofEscherichiacoilusing exponential feeding combined with pH-state[J]. Bioprocess Bio-systems Engineering, 2004(26): 147-150.