高效液相色譜-可變波長檢測法用于上清丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高

周遠(yuǎn)雄 陳繁華

1.廣東省梅州市第二中醫(yī)醫(yī)院，廣東梅州 514071；2.廣東省梅州市食品藥品監(jiān)督檢驗所，廣東梅州 514071

上清丸是廣東聯(lián)康制藥有限公司的一個主打產(chǎn)品，藥品批準(zhǔn)文號為國藥準(zhǔn)字Z44022090-44022091，主要由菊花、薄荷、梔子、黃芩（酒炒）、黃柏（酒炒）、大黃（酒炒）等中藥組成的大蜜丸。功能主治清熱散風(fēng)，解毒，通便，用于頭暈耳鳴，目赤，鼻竇炎，口舌生瘡，牙齦腫痛，大便秘結(jié)，日常深受人們的歡迎。由于各種客觀原因，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]僅收載了傳統(tǒng)顯微鑒別方法，查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)有測定上清丸的連翹苷含量[2]、黃芩苷含量[3],并無同時測定君藥菊花中的綠原酸及黃芩中的黃芩苷。為了更好地提高藥品內(nèi)在質(zhì)量，現(xiàn)擬對該制劑進(jìn)行質(zhì)量評價和標(biāo)準(zhǔn)提高研究。本文采用高效液相色譜-可變波長檢測法增訂綠原酸及黃芩苷的含量同時測定方法，能夠進(jìn)一步快速提高上清丸的質(zhì)量，確保臨床應(yīng)用的科學(xué)安全有效可控性。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀（四元低壓梯度泵、真空脫氣機(jī)，安捷倫公司）；島津電子分析天平AUW220D（島津公司）；KQ-250DE數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

綠原酸對照品（批號：110753-201415，含量為96.2%）、黃芩苷對照品（批號：110715-201619，含量為93.5%）均由中國食品藥品檢定研究院提供；上清丸（廣東聯(lián)康制藥有限公司，批號為：160402、160601、170501）；各陰性制劑均由廣東聯(lián)康制藥有限公司生產(chǎn)提供；乙腈為色譜級；乙醇等其余試劑為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為CAPCELL PAK C18(資生堂）（250×4.6mm，5μm）。 以 乙 腈（A）-0.5% 磷 酸溶液（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0-～10min，15%A；10 ～ 15min，40%A；25 ～ 30min，40%A；30～ 32min，15%A），流 速 1.0mL/min，檢 測 波 長（0～ 10min：327nm；10～ 30min：274nm）柱 溫30.0℃；進(jìn)樣體積10μL。綠原酸及黃芩苷主峰與相鄰峰分離良好，理論板數(shù)均能達(dá)到4000以上。

2.2 對照品溶液的制備

稱取綠原酸對照品0.01574g，黃芩苷對照品0.01338g置250mL容量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品大蜜丸，剪碎，混勻，取約0.5g精密稱定，精密加入稀乙醇25mL，稱定重量，超聲處理20分鐘（功率 250W，頻率 32KHz），取出，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，進(jìn)樣前用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 專屬性試驗

按處方及工藝制備不含菊花和黃芩的陰性樣品，再按照“2.3”項制備陰性對照液。結(jié)果顯示陰性無干擾，見圖1。

2.5 線性關(guān)系試驗

分別精密吸取“2.2”項下的混合對照品溶液2μL、5μL、10μL、20μL 和 30μL 進(jìn)樣。記錄峰面積，以綠原酸、黃芩苷的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，分別得方程Y=2.63589X+1.26902（r=0.9999）；Y=14.76628X+0.16393（r=0.9999）， 表明綠原酸在12.1135～181.7025μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；黃芩苷在10.0082～150.1236μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗

取同一批號樣品6份，按“2.3”項下方法制備，測定，結(jié)果RSD為0.97%（n=6）。

2.7 穩(wěn)定性試驗

精密吸取供試品溶液 10μL，分別于 0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣，結(jié)果綠原酸峰面積的RSD為0.93%，黃芩苷的RSD為0.78%。表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

圖1 HPLC色譜圖（327nm，274nm）

2.8 加樣回收率試驗

取樣品（批號為160601），剪碎混勻，精密稱取6份，每份0.25g，置具塞錐形瓶中，加入等量的對照品，按“2.3”項下提取方法制備成供試品溶液，進(jìn)樣分析，見表1。

2.9 樣品含有量測定

取 3批 樣 品（批 號 分 別 為 160402、160601、170501）按“2.3”項下方法制備成供試品溶液，測定，計算含量，見表2。

3 討論

3.1 成分的選擇

君藥菊花的有效成分為綠原酸和黃酮類，綠原酸已被證明具有抗菌、抗炎作用、抗疲勞、降血脂和免疫調(diào)節(jié)作用等[4-5]。而黃芩含有黃芩苷、黃芩苷元、漢黃芩素等，其中黃芩苷是其主要活性成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗過敏等作用[6-8]，因此選擇綠原酸和黃芩苷進(jìn)行含量考察。

3.2 檢測波長的選擇

參考相關(guān)文獻(xiàn)[9-16]綠原酸在327nm處有最大吸收而黃芩苷則在274nm處有最大吸收，兩者在碳十八色譜柱上的保留時間相差亦較大，為節(jié)省分析時間，采用梯度洗脫并可變波長檢測的方法能夠很好分離。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

表2 含有量測定結(jié)果（mg/g）

3.3 提取參數(shù)的選擇

綠原酸是由咖啡酸與奎尼酸形成的酯，其分子結(jié)構(gòu)中有酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚，其可利用乙醇、丙酮、甲醇等極性溶劑提取出來。黃芩苷是從黃芩根中提取分離出來的一種黃酮類化合物，難溶于有機(jī)溶劑，考慮選擇毒性很小的稀乙醇作為提取溶劑。提取方法有加熱回流法、超聲處理法和浸漬法等，由于加熱回流法效率比超聲法低，而浸漬法耗時長，因此選擇了超聲處理方法，經(jīng)方法學(xué)考察選擇的提取參數(shù)能最大限度提取出目標(biāo)成分。

3.4 流動相的選擇

本文曾經(jīng)參考藥典，選擇“甲醇-水-冰醋酸（55：45：1）”和“乙腈 -0.5% 磷酸溶液（9：91）”作為流動相。綠原酸可以有效分離，但是黃芩苷和相鄰的色譜峰不能完全分離。經(jīng)試驗，用本文中的梯度洗脫可以達(dá)到系統(tǒng)適用性的要求。

本文用于檢測綠原酸和黃芩苷的含量，分離好專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確可信度高，精密度和線性關(guān)系均良好，可用上清丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制。

[1] 國家藥典委員會.《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十冊》[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，1995：8.

[2] 李堅，陳作環(huán)，王玉紫，等.RP-HPLC法測定上清丸中連翹苷的含量 [J].湖北醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報，2012，31（4）：317-319.

[3] 肖燕.上清丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].中國民族民間醫(yī)藥，2008，23（8）：35-37.

[4] 李國棟，陳園園，王盼，等.野菊花中萜類和黃酮類化合物保肝作用研究[J].中草藥，2013，44（24）：3510-3514.

[5] 胡春，丁霄霖.菊花提取物對實驗動物抗疲勞和降血脂作用的研究 [J].食品科學(xué)，1996，17（10）：58-62.

[6] 洪鐵，楊振，繩娟，等．黃芩苷抗腫瘤作用及機(jī)制的研究 [J]．中國藥理學(xué)通報，2008，24（12）：1676-1678．

[7] 吳梅，閆慧，張春梅．黃芩苷作為一種抗生物制劑的過敏反應(yīng)研究[J]．微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2007，35（4）：48-50．

[8] 侯艷寧，朱秀媛，程桂芳．黃芩苷的抗炎機(jī)理[J]．藥學(xué)學(xué)報，2000，35（3）：161-164.

[9] 師永清，康淑荷，王愛軍.HPLC法同時測定黃連雙清丸中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿和大黃素的含量 [J].藥物分析雜志，2013，33（9）：1612-1614.

[10] 孫承浩，王吉華.HPLC同時分析穹菊上清丸中7個化學(xué)成分的含量研究[J].中國生化藥物雜志，2014，34（7）：177-179.

[11] 龔湛文，石任兵，劉斌.RP-HPLC測定葛根芩連湯有效部位中黃芩苷和葛根素的含量[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2003，26（3）：50-52.

[12] 蘇靜華，張超，孫磊，等.HPLC法同時測定黃連上清片的黃芩-黃連-黃柏藥對中9個指標(biāo)性成分的含量[J].藥物分析雜志，2015，35（11）：1940-1945.

[13] 黃燕萍，黃焜.HPLC法同時測定梔子金花丸中梔子苷和黃芩苷的含量 [J].中國藥事，2010，24（10）：1002-1004.

[14] 劉冰，王蓉華，徐永波.HPLC法同時測定銀黃膠囊中綠原酸、黃芩苷含量 [J].中國藥事，2006，20（5）：303-304.

[15] 謝東，高彩虹.高效液相色譜法測定銀黃軟膠囊中綠原酸和黃芩苷的含量[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2006，26（5）：631-632.

[16] 國家藥典委員會.《中國藥典》一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：301、310.