鹽酸維拉帕米緩釋片微生物限度檢查方法學(xué)的建立

余展旺 吳偉東 羅達(dá)敏

深圳技師學(xué)院應(yīng)用生物系，廣東深圳 518116

鹽酸維拉帕米緩釋片用于原發(fā)性高血壓，化學(xué)名稱：α-[3-][2-（3，4-二甲氧苯基）乙基]甲氨基]丙基] -3，4-二甲氧基-α-異丙基苯乙腈鹽酸鹽。分子式：C27H38N2O4·HCl。鹽酸維拉帕米為鈣離子拮抗劑，鈣離子拮抗劑又稱鈣通道阻滯劑（CCB），通過調(diào)節(jié)心肌傳導(dǎo)細(xì)胞、心肌收縮細(xì)胞以及動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞膜上的鈣離子內(nèi)流，發(fā)揮其藥理學(xué)作用，但不改變血清鈣濃度。該藥是我國高血壓患者最常使用的一類降壓藥[1]，《中國藥典》2015年版二部收載有該品種[2]。根據(jù)《中國藥典》2015年版四部相關(guān)規(guī)定，鹽酸維拉帕米緩釋片應(yīng)進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測(cè)定及大腸埃希菌的檢查[3]。在建立藥品的微生物限度檢驗(yàn)方法應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合該產(chǎn)品的微生物限度檢查，從而保證所建立檢驗(yàn)方法的科學(xué)性和檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本品微生物限度檢查方法學(xué)的建立如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），濕熱滅菌柜（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司），生物安全柜（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司），干熱滅菌柜（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司），電子天平 （賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；勻漿儀 （上海炳隆機(jī)電設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸維拉帕米緩釋片（批號(hào)20151201、20151202、20151203），硫氰酸銨。

1.3 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；麥康凱液體培養(yǎng)基；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基；pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基。

1.4 驗(yàn)證用菌株

銅綠假單胞菌 [CMCC（B）10104]； 金黃色葡萄球菌 [CMCC（B）26003]； 枯草芽孢桿 菌 [CMCC（B）635011]；白色念珠菌 [CMCC（B）98001]； 黑曲霉[CMCC（B）98003]， 中國食品藥品檢定研究院提供。

1.5 試驗(yàn)菌懸液的制備[2]

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入3～5mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。

1.6 中和劑的制備

以硫氰酸銨（1g/100mL）作為中和劑，用pH 7.0緩沖液作為溶劑來溶解硫氰酸銨。采用過濾法除菌。

1.7 常規(guī)法菌落回收率試驗(yàn)

1.7.1 供試液的制備 稱取供試品10g，置于研缽中研成細(xì)粉，轉(zhuǎn)移至無菌三角瓶中，加入pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液400mL，置勻漿儀500轉(zhuǎn)/min勻漿5min，既得1∶40供試液。

1.7.2 供試品試驗(yàn)組 取上述供試液，分裝為50mL/瓶，分裝5瓶，在分配好的供試液中加入0.5mL濃度為103～104cfu/mL的實(shí)驗(yàn)菌（實(shí)驗(yàn)菌分別為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌）混勻，制成試驗(yàn)組樣品溶液。采用平皿法，取上述試驗(yàn)組樣品溶液1mL加入無菌平皿中，每種試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿。其中金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌傾注TSA，白色念珠菌及黑曲霉菌應(yīng)同時(shí)傾注TSA及SDA。

1.7.3 菌液對(duì)照組 取pH7.0緩沖液，分裝至5個(gè)三角瓶中，每瓶50mL，加入目標(biāo)稀釋級(jí)103～104cfu/mL的菌液各0.5mL，混勻，作為菌液對(duì)照組。取1mL加入無菌平皿中，每種試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿。

1.7.4 供試品對(duì)照組 取供試品1mL加入無菌平皿中，傾注已融化的TSA及SDA，每種培養(yǎng)基平行制備2個(gè)平皿。

1.7.5 陰性對(duì)照組 取pH7.0緩沖液1mL加入無菌平皿中，傾注已融化的TSA及SDA，每種培養(yǎng)基平行制備2個(gè)平皿。

1.7.6 需氧菌于30～35℃培養(yǎng)≤3d，霉菌及酵母菌于20～25℃培養(yǎng)≤5d。菌落回收率%=（試驗(yàn)組菌數(shù)-供試液對(duì)照組菌數(shù)）/菌液對(duì)照菌數(shù)×100%。

1.8 中和法菌落回收率試驗(yàn)

用不同類別的微生物考察供試液是否有抑菌性及檢驗(yàn)程序的可靠性，將驗(yàn)證試驗(yàn)分成5組，并計(jì)算試驗(yàn)組和中和劑毒性組的菌回收率。

1.8.1 供試液制備 稱取鹽酸維拉帕米緩釋片10g，置于無菌三角瓶中，加入含硫氰酸銨（1g/100mL）的pH 7.0緩沖液500mL充分混勻，讓其反應(yīng)完全，即得1∶50供試品溶液。

1.8.2 供試品試驗(yàn)組 取供試液100mL，分裝5個(gè)三角瓶，每瓶20mL。在分裝好供試液試的三角瓶中分別加入0.2mL的目標(biāo)菌懸液（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉，濃度為103～104cfu/mL）即得供試品試驗(yàn)組溶液。取上述溶液1mL加入無菌平皿中，每種試驗(yàn)菌平行制備2皿。其中金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌傾注培養(yǎng)基TSA，白色念珠菌、黑曲霉分別傾注培養(yǎng)基TSA及SDA。

1.8.3 中和劑毒性組 取含硫氰酸銨（1g/100mL）的pH 7.0緩沖液100mL，分裝5個(gè)無菌三角瓶中，每瓶20mL。在分裝好的中和劑三角瓶中分別加入0.2mL的目標(biāo)菌懸液即得中和劑組溶液。取上述溶液1mL加入無菌平皿中，傾注對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基，待凝固后倒置培養(yǎng)，每種試驗(yàn)菌平行制備2皿進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。

1.8.4 菌液對(duì)照組，供試品對(duì)照組，陰性對(duì)照組：方法同常規(guī)法。

1.8.5 培養(yǎng)及計(jì)數(shù) TSA平皿于30～35℃培養(yǎng)不超過3d；SDA平皿于20～25℃培養(yǎng)不超過5d。結(jié)果觀察和計(jì)數(shù)逐日點(diǎn)計(jì)平板菌落數(shù)，并記錄結(jié)果，以最終的時(shí)間計(jì)數(shù)為準(zhǔn)。

1.9 控制菌檢查

1.9.1 供試液增菌培養(yǎng)

1.9.1.1 供試品試驗(yàn)組 采用中和法制備供試液，取含有103～104cfu/mL的大腸埃希菌菌懸液0.5mL分別加入含有50mL供試液的三角瓶中，搖勻。取10mL接種至100mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24h，必要時(shí)可延長至48h。

1.9.1.2 菌液對(duì)照組 取含有102～103cfu/mL的試驗(yàn)菌菌懸液0.5mL分別加入含有50mL pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的三角瓶中，其余操作同供試品試驗(yàn)組。

表1 常規(guī)法菌落回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 中和法菌落回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3 大腸埃希菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果

1.9.1.3 供試品對(duì)照組 取供試品10mL直接接種至100mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，其余操作同供試品試驗(yàn)組。

1.9.1.4 陰性對(duì)照組 取10mL pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液接種至100mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，其余操作同供試品試驗(yàn)組。

1.9.2 選擇和分離培養(yǎng) 取上述培養(yǎng)物各1mL，分別接種至100mL麥康凱液體培養(yǎng)基中，42～44℃培養(yǎng)24～48h，取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72h。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)法菌落回收率試驗(yàn)結(jié)果

從常規(guī)法菌落回收率試驗(yàn)可看出該藥品對(duì)微生物有抑菌性見表1，其中金黃色葡萄球菌的回收率為2.6%，枯草芽孢桿菌回收率為1.7%，兩種菌的回收率均不在藥典規(guī)定的50%～200%的范圍內(nèi)，可見鹽酸維拉帕緩釋片對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有較強(qiáng)的抑菌性，采用常規(guī)平皿法不能消除其干擾，應(yīng)重新開發(fā)方法，找到適合的中和劑。

2.2 中和法菌落回收率試驗(yàn)和大腸埃希菌檢查結(jié)果

采用硫氰酸銨（1g/100mL）作為中和劑，在3次獨(dú)立平行試驗(yàn)中，五種菌的試驗(yàn)組回收率和中和劑組回收率均在50%～200%之間，符合藥典要求，此中和劑能消除鹽酸維拉帕米緩釋片的抑菌性且對(duì)五種菌無抑制，可按此方法進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，見表2。大腸埃希菌檢查結(jié)果：試驗(yàn)組、菌液對(duì)照組均檢出實(shí)驗(yàn)菌，且菌落形態(tài)符合藥典個(gè)要求，供試品組、陰性對(duì)照組均無菌生長。見表3。

微生物限度檢查法方法驗(yàn)證工作十分繁瑣，影響因素包括培養(yǎng)基、菌株、實(shí)驗(yàn)步驟和供試品的制備方式[4]。為盡量減小誤差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果點(diǎn)計(jì)時(shí)以兩人交叉點(diǎn)計(jì)的方式進(jìn)行計(jì)數(shù)，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前進(jìn)行菌種傳代，傳代結(jié)束后直接接種，以保持菌液中活菌數(shù)量，提高菌活性，減少菌液濃度計(jì)算誤差。

3 討論

《中國藥典》2015年版以整合先進(jìn)理念、借鑒吸收國外藥典先進(jìn)技術(shù)經(jīng)驗(yàn)、兼顧國情為主要原則對(duì)微生物限度檢查法在適用范圍、檢測(cè)環(huán)境、檢測(cè)方法、培養(yǎng)體系及質(zhì)量控制理念等方面都做了較大修訂，并將微生物限度檢查法完善成為更加科學(xué)并與國際接軌的檢查方法[5-6]。

如果供試品對(duì)微生物生長的抑制作用無法以其他方法消除，供試液可經(jīng)過中和、稀釋或薄膜過濾處理后再加入試驗(yàn)菌懸液進(jìn)行方法適應(yīng)性試驗(yàn)。中和法在微生物限度檢查的廣泛應(yīng)用，可明顯降低抑菌性藥物的抑菌能力，提高菌的回收率。張光華等[7]用 3%聚山梨酯 80和 0.3%蛋黃卵磷脂作為中和劑來進(jìn)行化學(xué)藥的微生物限度檢查，可明顯降低藥品的抑菌性。 孫偉等[8]用β-環(huán)糊精作為中和劑來消除喹諾酮類抗生素藥品抑菌活性， 解決該類藥品微生物限度檢查方法建立困難問題?！吨袊幍洹?015年版從執(zhí)行至今兩年，對(duì)新版藥典微生物限度檢查方法的研究與應(yīng)用的報(bào)道在不斷增多，其中有不少研究報(bào)道是采用了中和法[9-15]。

用標(biāo)準(zhǔn)菌株評(píng)價(jià)鹽酸維拉帕米緩釋片微生物限度檢查方法對(duì)檢品中微生物的抑菌性。在中和法實(shí)驗(yàn)中試驗(yàn)組和中和劑對(duì)照組的回收率均大于50%，試驗(yàn)組回收率最低的一次是枯草芽孢桿菌為79.3%，最高的是用SDA培養(yǎng)的黑曲霉，結(jié)果為107.0%，之前對(duì)藥品有抑菌性的金黃色葡萄球菌回收率也符合要求，最低為95.2%，最大為104.8%，可排除該藥品對(duì)微生物的抑菌性，且在方法驗(yàn)證執(zhí)行過程中無偏差、無變更。平行三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果回收率均在50%～200%范圍內(nèi)。

綜上所述，在當(dāng)前實(shí)驗(yàn)檢測(cè)條件下，鹽酸維拉帕米緩釋片微生物限度計(jì)數(shù)方法適用性實(shí)驗(yàn)可按此驗(yàn)證方法及檢測(cè)操作程序進(jìn)行日常檢測(cè)。企業(yè)生產(chǎn)的同一個(gè)品種，在原藥材產(chǎn)地、批次、炮制方法以及生產(chǎn)工藝發(fā)生改變的時(shí)候，也應(yīng)該進(jìn)行方法確認(rèn)其檢查方法的可行性[16]。本研究建立的方法可為不同企業(yè)生產(chǎn)的同類品種的微生物限度檢查方法提供參考。

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