費(fèi)休氏容量法測量凍干人用狂犬病疫苗中水分含量的不確定度分析

邱文娜 饒 玲 王永智 方朝東 李 磊

江蘇省泰州醫(yī)藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)疫苗工程中心，江蘇泰州 225300

狂犬病是由狂犬病毒所致的人畜共患急性傳染病，流行性廣，病死率100%，有效預(yù)防該病的措施是接種狂犬病疫苗[1]。目前，上市的狂犬疫苗有兩種劑型，凍干粉針劑因技術(shù)含量高、易于保存、免疫反應(yīng)輕等特點(diǎn)，將逐步成為市場主流。水分含量是凍干粉針劑疫苗穩(wěn)定性相關(guān)的一個(gè)重要參數(shù)，在日常質(zhì)檢過程中諸多因素會(huì)影響該檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[2-6]。

本實(shí)驗(yàn)室該項(xiàng)檢測項(xiàng)目于2012年獲得CNAS認(rèn)可，曾兩次參加CNAS組織的測量審核、能力驗(yàn)證，且結(jié)果均為滿意。本文利用瑞士萬通870型水分測定儀測定凍干人用狂犬病疫苗中的水分含量，根據(jù)日常檢測經(jīng)驗(yàn)對影響測定結(jié)果的四大因素進(jìn)行不確定度評定，該因素包括測量重復(fù)性、卡爾費(fèi)休試液滴定度、卡爾費(fèi)休試液滴定體積、稱樣量[7-10]。依據(jù)不確定評定方法，建立不確定度分析的數(shù)學(xué)模型， 逐步考察各不確定度分量，找出分析過程中的關(guān)鍵點(diǎn)，為日常檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性提供依據(jù)[11-15]。

1 材料與方法

1.1 樣品

凍干人用狂犬病疫苗，由中心內(nèi)疫苗研發(fā)企業(yè)提供。

1.2 主要試劑及儀器

無水甲醇（分析純，含水量＜0.1%）；卡爾費(fèi)休試劑（批號 SZBD0490V，Sigma Fluka）；標(biāo)定用水；電子天平（Sartorius BSA224S-CW）；卡爾-費(fèi)休水分測定儀（瑞士萬通KF 870型）；微量注射器、藥匙。凡與樣品或費(fèi)休氏試液直接接觸的物品，如稱量勺、玻璃器皿、橡皮塞均應(yīng)在80℃干烤2h，取出置干燥器內(nèi)冷卻20min備用。

1.3 環(huán)境要求

環(huán)境濕度對檢測結(jié)果影響較大，且卡爾費(fèi)休試液具有吸水性，因此水分檢測實(shí)驗(yàn)室濕度需低于50%，儀器干燥用分子篩需狀態(tài)良好，與樣品直接接觸的稱量紙、稱量勺、搗碎工具均需80℃干燥。

1.4 檢測方法

1.4.1 滴定杯微環(huán)境的平衡 加入50mL無水甲醇至滴定杯中，啟動(dòng)儀器平衡模式，消除滴定杯中存在多余水分干擾，等待儀器顯示conditioning ok，即漂移值小于20μL/S時(shí)，即可開始標(biāo)定。

1.4.2 卡爾費(fèi)休溶液的標(biāo)定 選擇Titer標(biāo)定模式，使用尖頭微量注射器吸取約20mL標(biāo)定用水，注意排除氣泡，精密稱定注射器和水樣質(zhì)量并做好記錄，選擇儀器進(jìn)樣鍵，快速加入水樣至滴定杯中，再次精密稱定注射器質(zhì)量，兩次質(zhì)量之差即加入的標(biāo)定用水質(zhì)量，將進(jìn)樣量輸入儀器，按start鍵開始滴定，滴定結(jié)束后，儀器自動(dòng)顯示本次標(biāo)定消耗卡爾費(fèi)休試液體積、滴定度F值，如此連續(xù)測定3次，3次連續(xù)標(biāo)定結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在±1%以內(nèi)，以平均值作為卡爾費(fèi)休試液的滴定度。

1.4.3 供試品的測定 選擇KFT測定模式，天平去皮，精密稱定供試品90～100mg置干燥的稱量紙中，記錄進(jìn)樣前質(zhì)量，選擇儀器進(jìn)樣鍵，快速加入供試品至滴定杯中，精密稱定稱量紙質(zhì)量，兩次質(zhì)量之差即加入的供試品質(zhì)量，將進(jìn)樣量輸入儀器，按start鍵開始滴定，滴定結(jié)束后，儀器自動(dòng)顯示本次標(biāo)定消耗卡爾費(fèi)休試液體積、供試品含水量。

2 不確定度分析

2.1 數(shù)學(xué)模型和不確定度來源分析

依據(jù)中國藥典2015版通則0832卡爾費(fèi)休容量法測定原理及萬通水分測定儀測定流程，供試品含水量公式為：

其中V1為稱取的供試品消耗的費(fèi)休氏試液的體積，mL；W1為供試品進(jìn)樣量，mg；F為卡爾費(fèi)休試液標(biāo)定F值的平均值，mg/mL；W為標(biāo)定中消耗的標(biāo)定用水的質(zhì)量，mg；V為標(biāo)定中標(biāo)定用水消耗的費(fèi)休氏試液的體積，mL。

根據(jù)公式（1）可知，卡爾費(fèi)休容量法檢測供試品含水量的不確定度主要來自：（1）測量重復(fù)性；（2）供試品進(jìn)樣量；（3）供試品消耗的卡爾費(fèi)休試液體積；（4）卡爾費(fèi)休試液滴定度F值。本實(shí)驗(yàn)在標(biāo)定及檢測開始前均有平衡過程，漂移值保持在20μL/s以內(nèi)，消除了溶劑中水分的影響，所以本文忽略考察無水甲醇溶劑中水分帶來的不確定度。實(shí)驗(yàn)采用的水分測定儀可自動(dòng)判斷滴定終點(diǎn)，消除人為影響，操作全過程環(huán)境濕度低于50%，與供試品接觸直接接觸實(shí)驗(yàn)材料均經(jīng)過80℃干燥，且密閉的滴定杯連接有分子篩干燥劑，因此忽略考慮由終點(diǎn)判斷和環(huán)境水分引起的不確定度。

2.2 各分量標(biāo)準(zhǔn)不確定的評估

2.2.1 測量重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量Urel（x）

稱取同一批次樣品3份，測定含水量，結(jié)果如下：2.54%，2.59%，2.57%；平均值為2.57%。

根據(jù)貝塞爾公式實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

結(jié)果平均值的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 稱取的供試品質(zhì)量W1引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（W1） 供試品稱量不確定度來自天平稱量重復(fù)性和天平校準(zhǔn)兩個(gè)方面。本實(shí)驗(yàn)所用電子天平精度為d=0.01mg，天平檢定證書列出的重復(fù)性誤差為±0.05 mg，屬 B 類不確定度，按矩形分布（包含因子），天平稱量重復(fù)性的不確定度為天平校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度，所用電子天平（d=0.01mg）的檢定證書給出的最大允差為±0.03 mg，屬 B 類不確定度，按矩形分布（包含因子），天平校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度為：

因此，單次稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，樣品稱量帶來的相對不確定度為（樣品稱樣量為95.4mg，

2.2.3 供試品消耗的費(fèi)休氏試液的體積V1引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（V1）

該不確定度分量主要來源于滴定管校準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)室溫度波動(dòng)兩個(gè)方面，滴定管校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度U1（V1），根據(jù)水分測定儀技術(shù)報(bào)告得知10mL滴定管的最大允差為0.02mL，按三角分布，標(biāo)準(zhǔn)不確定度實(shí)驗(yàn)室溫度變動(dòng)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度U2（V1），根據(jù)儀器資料，10mL滴定管校準(zhǔn)溫度為20℃，而本實(shí)驗(yàn)室溫度在25℃，實(shí)驗(yàn)室溫度變化近似為矩形分布，屬于B類不確定度。本實(shí)驗(yàn)所用卡爾費(fèi)休試劑膨脹系數(shù)為1.2×10-3/℃，V1均值為0.6044mL（0.6103，0.6280，0.5750），標(biāo) 準(zhǔn) 不 確 定 度 U2（V1）=0.6044×5×1.2×10-3/= 2.09×10-3mL，將U2（V1）兩個(gè)分量進(jìn)行合成，得到相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2.4 標(biāo)定結(jié)果F值引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

卡爾費(fèi)休試液滴定度F值引入的不確定度由標(biāo)定用水質(zhì)量、標(biāo)定時(shí)消耗的卡爾費(fèi)休試液體積、標(biāo)定操作重復(fù)性、標(biāo)定用水純度構(gòu)成，因本實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)定用水缺少證書，所以該項(xiàng)不確定度分量不予考慮。

標(biāo)定用水質(zhì)量引入的不確定度U1（m1），因與供試品稱量共同同一臺(tái)天平，由2.2.2可知單次稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u（mi）=0.0337，標(biāo)定用水稱量帶來的相對不確定度為（標(biāo)定用水稱樣量mi為19.9mg，mi為 19.8、19.9、20.1）：

標(biāo)定時(shí)消耗的卡爾費(fèi)休試液體積引入的相 對 標(biāo) 準(zhǔn) 不 確 定 度 U2（V標(biāo)），由 2.2.3可 知，U（V標(biāo)1）=0.02/=0.00816mL，V 標(biāo) 均 值為 4.9222mL（4.9114，4.9070，4.9481）U（V標(biāo)2）=4.9222×5×1.2×10-3/= 1.705×10-2mL，將 U2（V標(biāo)1）、U2（V標(biāo)2）兩個(gè)分量進(jìn)行合成，得到相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

標(biāo)定操作重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度U3（x），通過平行試驗(yàn)3次，測得F值分別為4.0314，4.0554，4.0622，由2.2.1貝塞爾公式可知其標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.01618，平均值為4.0497，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度U3（x）為 0.00400。

將 U2（m1）、U2（V標(biāo)）、U3（x）進(jìn)行合成，F(xiàn) 值的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2.5 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算

表1 各分量的不確定度評估表

以相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的平方和進(jìn)行合成，得到合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2.6 擴(kuò)展不確定度的計(jì)算

取包含因子K=2，置信概率為95%，水分測定結(jié)果的擴(kuò)展不確定度為：U（x）=K×Uc（X）=2×0.041%=0.082%。

2.2.7 報(bào)告不確定度

本實(shí)驗(yàn)室按照現(xiàn)行藥典標(biāo)準(zhǔn)測定凍干人用狂犬病疫苗含水量，取包含因子K=2，置信概率為95%，檢測結(jié)果可表示為含水量X=2.57%±0.082%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，卡爾費(fèi)休水分測定法不確定度來源主要涉及測量重復(fù)性、供試品質(zhì)量、卡爾費(fèi)休試液消耗體積及標(biāo)定F值，其中供試品消耗的卡爾費(fèi)休試液體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.0139，所占比例最大，其次為標(biāo)定結(jié)果F值和測量重復(fù)性引入的不確定度，影響標(biāo)定結(jié)果F值的各不確定度分量中，標(biāo)定時(shí)的卡爾費(fèi)休試液體積和標(biāo)定重復(fù)性引入的不確定度相當(dāng)，且遠(yuǎn)大于標(biāo)定用水質(zhì)量引入的不確定度，標(biāo)定重復(fù)性和測量重復(fù)性引入的不確定度屬于A類不確定度，描述了各個(gè)測量值的分散度，因本實(shí)驗(yàn)室在長期日常檢測中標(biāo)定和測量重復(fù)性較好，所以觀測次數(shù)n取了三次，當(dāng)重復(fù)性較差時(shí)，n應(yīng)相應(yīng)增大，以客觀計(jì)算該項(xiàng)不確定度值。由于本實(shí)驗(yàn)采用減量法稱重，兩次稱量的校準(zhǔn)偏差相互抵消，所以樣品稱量引入的不確定度最小，可以忽略不計(jì)。

由表1中各不確定度分量評估可知，使用費(fèi)休氏容量法測量凍干人用狂犬病疫苗中水分含量時(shí)，需根據(jù)樣品性質(zhì)選用滴定度穩(wěn)定的卡爾費(fèi)休試劑，并嚴(yán)格控制水分檢測實(shí)驗(yàn)室的溫濕度環(huán)境條件（濕度控制在50%以內(nèi)），每月更換水分測定儀干燥用分子篩，控制平衡時(shí)間在5min以內(nèi)，平衡時(shí)間過長時(shí)需注意考慮卡爾費(fèi)休試液穩(wěn)定性、無水甲醇是否新?lián)Q及滴定杯內(nèi)微環(huán)境等因素，逐一排查。標(biāo)定時(shí)控制連續(xù)三次測定的F值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在±1%以內(nèi)，以最大降低由卡爾費(fèi)休試液體積、F值帶來的不確定度。樣品稱量引入的不確定度雖然最小，但當(dāng)進(jìn)樣方式不正確時(shí)，質(zhì)量比較輕的凍干粉類樣品會(huì)飄濺到滴定杯壁上，本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)總結(jié)應(yīng)選用質(zhì)地較硬的硫酸紙進(jìn)行稱量，并將硫酸紙剪成合適的形狀，以減少進(jìn)樣時(shí)的樣品損失。檢測實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)設(shè)置烘箱，凡與樣品直接接觸的稱量勺、燒杯，都應(yīng)進(jìn)行80℃長時(shí)間烘干，并做到取樣快， 稱量快，轉(zhuǎn)移快， 盡量使樣品暴露在空氣中的時(shí)間最短，以降低系統(tǒng)漂移。當(dāng)兩次檢測間隔時(shí)間過長時(shí)，需更換滴定杯中溶劑無水甲醇，以降低反應(yīng)微環(huán)境中水分的影響。

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