新型肝臟腫瘤介入治療后復發與轉移預測方法的建立

孫慧偉，謝輝，李瑞生，李曉娟，柴燕濤，姜棋予，王志杰，楊銳創，馮帆，侯俊

解放軍第三〇二醫院 a.臨床研究管理中心；b.介入科；北京 100039

原發性肝臟腫瘤主要包括肝細胞癌（hepato?cellularcar cinoma，HCC）和肝內膽管細胞癌（intra?hepatic cholangiocarcinoma，IHC）2個病理分型[1-2]，其中HCC是主要的病理類型。絕大多數HCC患者初診即為進展期（advancedHCC），失去外科手術等根治性治療機會[3-4]。HCC細胞對放射治療不敏感[5]，同時具有對各種細胞毒性化療藥物的多藥耐受（multi-drug resistance，MDR）特性[6]，而惟一的肝細胞癌一線治療藥物——口服多靶標蛋白激酶抑制劑索拉菲尼（sorafenib）的臨床獲益個體差異極大，只有25%～40%的HCC患者對其有應答，隨著治療的進展，大多數對索拉非尼初始敏感的患者也會出現耐藥[7]。目前，以經導管動脈化學栓塞TACE（transcatheter arterial chemoem?bolization，TACE）為代表的介入治療策略在肝臟腫瘤診療中具有重要意義，能夠起到延緩疾病進展，降低患者腫瘤負荷，提高生存質量的作用[8-10]。但另一方面，介入治療也有可能作為強有力的殺傷因素，破壞腫瘤組織的構架或微環境，造成腫瘤細胞逃逸或散逸[11]；或作為脅迫因素，誘導和活化肝臟腫瘤細胞中各種脅迫應答機制，發揮對治療的耐受或最終導致復發[11]。

我們在臨床診療中已觀察到，相當比例的肝臟腫瘤患者經介入治療后，無論是否接受手術切除，都會出現多發性甚至彌散性復發或轉移[12]。這一現象嚴重危害患者健康，影響臨床診療效果，但相關機制尚不清楚，也沒有對接受物理性局部治療的肝臟腫瘤患者復發、轉移與侵襲等預后進行檢測、判別或預測的方法。為解決這一問題，我們采用經TACE治療的肝臟腫瘤患者手術切除或內窺鏡引導下的手術切除標本，建立免疫缺陷動物（SICD小鼠）的肝臟原位腫瘤模型，通過B超探測和H&E、Masson染色等病理學分析方法對原位HCC病灶進行腫瘤的侵潤性生長，腫瘤侵襲與腫瘤血道轉移分析，最終判別和預測HCC的預后風險。

1 材料與方法

1.1 材料

對肝臟腫瘤患者進行行為評分，選取接受物理性局部策略進行降階梯治療的患者，若治療后其行為評分好轉，則接受開腹手術切除或腹腔內窺鏡引導的肝臟腫瘤切除手術，使用含20%胎牛血清的DMEM培養基保存標本外層性狀較好的部分。

SCID小鼠（C.B-17/lcr）由北京市斯貝福生物科技有限公司提供；吸入麻醉劑異氟烷為深圳沃瑞德公司產品；小動物實驗相關全套設備與手術器械由本實驗室保存；病理實驗H&E染色試劑盒與Masson染色試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.2 免疫缺陷小鼠肝臟原位模型的建立[13]

免疫缺陷（T、B細胞雙重缺失）雌性5～6周齡C.B-17/lcr品系SCID小鼠，在潔凈空間（SPE飼養條件）用60Co-γ照射除菌的墊料和飼料飼養。以異氟烷為麻醉劑，用麻醉機持續麻醉（首次麻醉時異氟烷濃度為3.5%，持續麻醉時異氟烷濃度為1.5%～2.0%）。將小鼠固定于粘鼠板上，在其腹部劍突下方剪開一個約1cm的開口，輕輕擠出肝右葉，用眼科鑷在肝葉表面制造孔洞后用滅菌棉簽按壓止血。剝取腫瘤標本外層生發層活性較好的組織，切成小塊（直徑1～1.5mm）后將腫瘤組織接種進肝葉的孔洞內，確定借種成功后按壓止血。將肝葉推回腹腔內，縫合創口，注意縫合的層次，縫合3～4針即可。如有少量出血則進行按壓止血。

1.3 原位腫瘤的B超探查[13]

前述免疫缺陷動物經過4周左右生長后，用深圳開立生物醫療有限責任公司的S40型B超設備，使用配套的L742型小器官超聲探頭進行常規B超探查，在右肝葉探查得到1～1.5mm的低回聲病灶時即可進行病理檢測。

1.4 H&E染色檢測

染液配制：①伊紅酒精溶液（1%）：稱取伊紅Y染料1g，加入少量蒸餾水溶解后，逐滴加入冰醋酸直至染料為糊狀，用濾紙過濾，將濾渣在烘箱中烤干后，用100mL95%酒精溶解；②蘇木素染液：稱取蘇木精6g，溶于100mL無水乙醇，再將150g硫酸鋁鉀溶于蒸餾水，溶液再與900mL甘油混合，最后加入120mL冰醋酸和1.2g碘酸鈉3即可；③分化液：將1mL濃鹽酸加入99mL 70%酒精中即可。

剝離前述免疫缺陷小鼠的肝右葉，用4%多聚甲醛固定24h后進行包埋、切片等常規操作。獲得的石蠟切片分別用二甲苯Ⅰ（15min）、二甲苯Ⅱ（15min）、1∶1二甲苯/無水乙醇（2min）、無水乙醇Ⅰ（5min）、無水乙醇Ⅱ（5min）、80%乙醇（5min）及蒸餾水（5min）依次處理脫蠟復水后，用蘇木精液染色（5min），水洗10min或流水沖洗5min，再用1%鹽酸乙醇分化30s后水洗30s、蒸餾水過洗5s，用伊紅液染色 1～3min，再分別用蒸餾水（30s）、80%乙醇（30s）、95%乙醇（1min）、95%乙醇（1min）、無水乙醇Ⅰ（3 min）、無水乙醇Ⅱ（3min）、二甲苯Ⅰ（3min）、二甲苯Ⅱ（3min）脫水后，用中性樹膠封片。將經H&E染色的病理切片在顯微鏡下檢測并拍照，識別腫瘤組織的特性。

1.5 Masson染色檢測

染液配制：①蘇木素染液：稱取蘇木精6g，溶于100mL無水乙醇，再將150g硫酸鋁鉀溶于蒸餾水，溶液再與900mL甘油混合，最后加入120mL冰醋酸和1.2g碘酸鈉3即可；②Masson立春紅酸性復紅液：稱取麗春紅0.7g、酸性復紅0.3g，量取冰醋酸1mL、蒸餾水99mL，充分混合后過濾即可；③0.2%冰醋酸水溶液：量取冰醋酸0.2mL溶于100mL蒸餾水；④1%磷鉬酸水溶液：稱取磷鉬酸1g溶于100mL蒸餾水；⑤苯胺藍水溶液：稱取苯胺藍2g、量取冰醋酸2mL，溶于98mL蒸餾水。

剝離前述免疫缺陷小鼠的肝右葉，用4%多聚甲醛固定24h后進行包埋、切片等常規操作。獲得的石蠟切片分別用二甲苯Ⅰ（15min）、二甲苯Ⅱ（15min）、1∶1二甲苯/無水乙醇（2min）、無水乙醇Ⅰ（5min）、無水乙醇Ⅱ（5min）、80%乙醇（5min）及蒸餾水（5min）依次處理脫蠟復水后，用蘇木精液染色（5～10min），充分水洗（10min以上）或流水沖洗5min以上，用Masson立春紅酸性復紅液染色5～10min，再以2%冰醋酸水溶液洗片刻，1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min，不經水洗，直接用苯胺藍水溶液染5min后以2%冰醋酸水溶液洗片刻，最后分別用蒸餾水（30s）、80%乙醇（30s）、95%乙醇（1min）、95%乙醇（1min）、無水乙醇Ⅰ（3min）、無水乙醇Ⅱ（3min）、二甲苯Ⅰ（3min）、二甲苯Ⅱ（3min）等脫水后，以中性樹膠封片。將經Masson染色的病理切片在顯微鏡下檢測并拍照，識別腫瘤組織的特性。

2 結果

2.1 H&E染色的病理學分析

我們對不同標本在SCID小鼠肝臟形成的腫瘤組織進行了H&E染色。由圖1可以看出，患者HCC手術切除標本接種于免疫缺陷小鼠肝臟，經過4周生長后形成的病灶（癌巢，nodules）能夠為H&E染色所確認，可清晰地看到病灶和周圍正常組織。在此基礎上對其性狀進行區分：圖1A為復發風險小、預后程度好的患者，其手術切除標本所形成的原位腫瘤界限清晰，癌巢（病灶）與其周圍組織有完整而清楚的界限或包膜；圖1B為復發風險大、預后程度差的患者，其手術切除標本所形成的原位腫瘤界限模糊，與周圍組織沒有清楚或明顯的界限。

2.2 Masson染色的病理學分析

我們用Masson染色對復發風險大、預后程度差的患者臨床標本在動物肝臟中形成的原位腫瘤進行了檢測，結果如圖2，Masson染色能夠清晰直觀地顯示腫瘤的彌散性侵襲、遷移或侵潤性生長，對腫瘤組織的惡變程度進行區分。圖2A示腫瘤呈侵潤性生長，可清晰辨識侵襲的腫瘤細胞，此時腫瘤組織惡變程度較輕；在此基礎上，用Masson染色能夠觀察到明顯的腫瘤細胞對正常組織構架或微環境的破壞，誘導相應組織重構后產生并形成的腫瘤血管，腫瘤血管的管腔較大，且血管壁缺乏纖維甚至是正常上皮細胞（圖2B），侵襲和侵潤性生長的腫瘤細胞誘導和參與形成內皮不完整、纖維不發達的腫瘤血管，進一步提示和反映了腫瘤的惡性程度；最后，部分標本的Masson染色能夠觀察到明顯的血道轉移現象（圖2C），肝臟主要血管的管腔較大，纖維豐富，且具備完整的管壁結構，腫瘤細胞通過主要血管的轉移顯示了其惡性強的轉移、侵襲能力。可以看出，肝臟的血管內有經由血管侵襲與侵潤性生長的腫瘤細胞，進一步反映出患者很高的復發風險和較差的預后。

圖1 腫瘤組織標本在SCID小鼠肝臟形成病灶的H&E病理學檢測

圖2 腫瘤組織標本在SCID小鼠肝臟形成病灶的Masson病理學檢測

3 討論

以TACE為代表的各種介入治療已成為進展期肝細胞癌診療的重要選擇，不僅能夠實現對腫瘤細胞的直接殺傷、縮小腫瘤，還可作為“降階梯”治療策略，減低患者腫瘤負荷并提高患者行為評分后進行手術切除或接受肝臟移植[11]。隨著TACE等的廣泛應用，其治療后的嚴重復發或轉移報道日益增多。最近的報道顯示，以HCC為代表的人類惡性腫瘤細胞一般通過3種機制逃逸抗腫瘤治療進而復發或轉移：①TACE等抗腫瘤治療策略能夠作為脅迫因素誘導Survivin、cIAP1、cIAP2及BCL-2等抗凋亡、促存活蛋白表達，以此增加HCC細胞的抗性，促進HCC細胞存活或治療耐受[14]；②如未能完全殺滅病變部位的全部HCC細胞，則有可能誘導殘存腫瘤細胞的上皮/間質轉化作用（epithelial-mesenchymaltransition，EMT），HCC細胞從偏向上皮特性轉向間質特性，在這一過程（EMT）中其抗性和侵襲性顯著上調[14-15]；③實體腫瘤具有異質性，TACE等抗腫瘤治療也有可能通過發揮克隆選擇的作用，促使病灶中相對靜止和極具抗性的一群細胞（即腫瘤干細胞相對富集，最終引起腫瘤的復發或轉移[11]。這提示我們，檢測TACE治療后腫瘤組織生物學行為、性狀的變化具有重要意義，有可能作為預測TACE治療后復發與轉移的有效策略。

本研究選取SCID小鼠（C.B-17/lcr）品系進行實驗。作為近年得到廣泛應用的新型腫瘤動物模型，SCID小鼠的T細胞與B細胞均缺失，比裸鼠（T細胞缺失）具有更大的優勢。TACE治療后的手術切除標本或肝臟穿刺標本，受手術或穿刺周期影響，HCC細胞的活性可能偏弱，SCID小鼠的應用極大地改善了這一限制。

在研究中，H&E、Masson染色的觀測指標明晰，圖像直觀且方法新穎。選取手術切除標本外層性狀較好的部分接種免疫缺陷小鼠肝臟，B超探測原位癌巢直徑達到1～1.5mm時可進行病理檢測。首先用H&E染色對腫瘤的性狀進行初步判斷，再利用Masson染色進行深入分析，檢測血管和纖維等結構，依據病理分析結果對預后風險等進行分級：①H&E染色結果顯示腫瘤界限清晰且包膜完整的記為Ⅰ級，患者復發風險小；②H&E染色結果顯示腫瘤界限不清晰無完整包膜的，Masson染色復檢顯示有腫瘤細胞侵潤或侵襲性生長的記為Ⅱ級，患者有復發風險，應定期進行影像學檢查和接受隨訪；③H&E染色結果顯示腫瘤界限不清晰無完整包膜的，Masson染色復檢顯示有腫瘤細胞侵潤、侵襲性生長與腫瘤血管生成的記為Ⅲ級，患者有較高復發風險，應考慮輔助化療后定期影像學檢查和接受隨訪；④H&E染色結果顯示腫瘤界限不清晰無完整包膜的，Mas?son染色復檢顯示有腫瘤細胞侵潤、侵襲性生長與腫瘤血道轉移情況的記為Ⅳ級，患者的復發風險極高，應考慮輔助化療后密切關注、定期影像學檢查和接受隨訪。

除TACE外，射頻消融（radiofrequencyablation，RFA）也是重要的介入治療策略，能夠較有選擇性地消融與殺傷腫瘤組織而非周圍組織[16]。RFA不僅有助于保護肝組織與正常肝臟功能，尤其適用于伴隨嚴重肝硬化的HCC患者[16]。與TACE治療類似，RFA治療也存在術后復發與轉移的問題[17-18]。本研究建立的方法，不僅有助于對TACE治療后患者HCC復發風險進行預測研究，也可用于RFA治療后患者HCC復發風險預測研究。