運用數字PCR檢測乳腺癌組織FFPE樣品中人表皮生長因子受體2拷貝數的變化

董周寰，張晶，王哲，許程程，王芳，宋海峰，付潔，石懷銀

1.解放軍總醫院 病理科，北京 100853；2.軍事科學院 軍事醫學研究院 生命組學研究所，蛋白質藥物國家工程研究中心，北京 102206；3.北京金則醫學科技發展有限公司，北京 102206；4.軍科正源（北京）藥物研究有限責任公司，北京 102206

人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2，又稱 ERBB2）是人表皮生長因子家族成員，其基因位于17號染色體。HER2過表達是促發多種腫瘤發生發展的關鍵因素，也是靶向治療選擇的關鍵指標之一[1-3]，抗體藥物赫賽汀可有效治療約25%的HER2高表達型乳腺癌[4]。研究表明，除乳腺癌外，胃癌等癌癥中HER2基因拷貝數會發生變異[5-6]，因此準確考察HER2基因拷貝數變化（copy number varia?tion，CNV），對于靶向治療意義重大。

目前臨床上常通過免疫組化（immunohisto?chemistry，IHC）和熒光免疫雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）的方法進行靶點確證，判斷患者疾病進程，但研究表明HER2檢測有10%～20%結果無法準確反映[7]，主要因素為：①操作者技術水平影響；②結果評判存在主觀性；③腫瘤的異質性導致取樣偏差[7-8]。另外，FISH是用探針檢測切片樣品中HER2、CEP-17的信號，通過HER2、CEP-17熒光信號的比值來評價HER2的擴增程度，但有文獻報道CEP-17本身可能也會異常擴增[9]，僅以其作為內參基因可能會導致部分患者不能受益于HER2靶向治療。

雖然FISH是目前檢測HER2CNV的金標準，但由于上述局限性，以及通量低成本較高，仍需要更為準確、客觀、較高通量、成本較低的檢測技術加以輔助甚至替代。數字PCR（droplet digi?talPCR，ddPCR）是目前最具潛力的檢測方法之一，早在20世紀90年代就有科學家提出ddPCR的概念[10-12]。近幾年，ddPCR在微生物[13]、拷貝數變異[14]、基因突變[15]等分析領域有突破性貢獻。ddPCR是組織提取后勻質狀態下靶分子的絕對定量技術，具有很高的靈敏度與準確性[16]。我們將ddPCR用于HER2CNV檢測，并與IHC、FISH結果進行比較，希望將ddPCR發展為IHC、FISH檢測的有力補充手段之一。

1 材料與方法

1.1 材料

收集解放軍總醫院2015年3～7月經病理確診為乳腺癌的福爾馬林固定石蠟包埋（formalinfixed and parrffin-embedded，FFPE）樣本 21例，其中IHC結果顯示為“++”樣品18例，“+++”樣品3例。該批樣本均經FISH方法檢測HER2CNV。

FFPE樣品DNA提取試劑盒購自凱杰公司；細胞基因組DNA（gDNA）提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；ddPCR探針法自動化微滴發生油、檢測預混液分析專用油購自Bio-Rad公司；HER2和CEP-17的DNA檢測引物探針序列由本實驗室參考文獻[17]及NCBIGenBank數據庫后利用軟件Prime5.0設計（表1），由上海生工公司合成；HER2IHC檢測一抗為兔IgG，購自中杉金橋生物技術有限公司，克隆號EP3；二抗檢測系統為羅氏Ventana公司的UltraView Universal DABDetection試劑盒；FISH檢測使用乳腺癌HER2基因檢測試劑盒（FISH法）（PathVysion）。

表1HER2及CEP-17引物探針序列

Bio-RadQX200自動化數字PCR系統（微滴生成儀器，微滴讀取儀器，T100PCR儀，熱封儀）；Thermo臺式離心機等實驗室常規儀器。

1.2 標本核酸提取

21例FFPE樣本經石蠟包埋后切片用于IHC及FISH檢測判斷患者病理情況，同時每個組織再切2片，厚度均為5μm，置于1.5mL無核酸酶EP管中，室溫保存。用凱杰公司FFPE樣品DNA提取試劑盒提取樣品gDNA，用NanoDrop檢測濃度、純度后以10μL/管分裝保存于-60℃～-90℃冰箱。

1.3 細胞系DNA提取

HER2表達正常型細胞系人胚腎細胞293T、人口腔上皮細胞HOEC，以及HER2陽性表達卵巢癌細胞系SKOV3購于ATCC并保存于本實驗室，收集對數生長期細胞，用細胞gDNA提取試劑盒提取gDNA，并經NanoDrop檢測濃度、純度后10 μL/管分裝，-60℃～-90℃保存。

1.4HER2、CEP-17ddPCR檢測方法建立

設計、合成HER2、CEP-17引物探針，以293T、HOEC、SKOV3細胞gDNA為模板建立反應體系及程序。ddPCR反應體系包括Supermix 10 μL，上、下游引物各 0.8 μmol/L，探針 0.25 μmol/L，DEPC水 4.3 μL，gDNA40ng/2 μL。將反應體系配置在96孔板后，在Bio-Rad自動化數字PCR微滴生成儀中生成微滴，封板后在普通PCR儀上進行擴增（擴增程序：95℃ 5min；94℃30s，60℃ 40s，40個循環；98℃ 10min）。擴增畢，用微滴分析儀及QuantaSoft軟件分析結果，得到每個樣品中HER2、CEP-17基因的拷貝數。

1.5 線性稀釋

將293T細胞gDNA用DEPC水稀釋至20ng/μL，并按1/5梯度稀釋為5個濃度水平，上樣量均為 2 μL/反應，即上樣量分別為 40、8、1.6、0.32、0.064ng/反應。按1.4中的反應體系及程序配置ddPCR樣品并進行檢測。

1.6 單通道、雙通道檢測方法比較

以梯度稀釋的293T細胞gDNA為模板建立雙通道反應體系（上樣量分別為40、8、1.6、0.32ng/反應），即HER2、CEP-17引物和探針于同管反應。同時從IHC檢測結果為“++”和“+++”的樣品中各隨機挑選1個（最終選擇樣本為9#、14#），制備CEP-17（FAM，藍色）及HER2（VIC，綠色）單通道反應體系和雙通道反應體系，反應程序與1.4中描述相同。

1.7 標本樣品ddPCR檢測

所有樣品均采用雙通道檢測法檢測，以Ratio（HER2/CEP-17）表述樣品中的HER2CNV。

1.8 標本樣品IHC及FFPE檢測

IHC檢測流程：石蠟切片脫蠟至水；pH9.0 EDTA溶液修復1h；3%H2O2室溫孵育10min以消除內源性過氧化物酶的活性；蒸餾水沖洗，PBS浸泡；滴加一抗工作液，37℃孵育1h；PBS沖洗3次；按說明書進行二抗孵育及顯色；自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。

FISH檢測按試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 細胞系HER2/CEP-17檢測結果

HER2正常表達型293T細胞和HOEC細胞HER2/CEP-17值分別為 1.20（8020/6700）和 1.24（7880/6360），SKOV3細胞HER2/CEP-17值為4.83（22010/4560）。

2.2 線性稀釋結果

為考察引物、探針響應性，以293T細胞gDNA樣品系列稀釋模板做線性考察，結果表明R2＞0.99，2種基因引物探針符合檢測要求，典型的ddPCR結果見圖1。

2.3 單通道、雙通道檢測結果

293T細胞gDNA稀釋至1/5，分別用CEP-17和HER2引物探針進行單通道、雙通道檢測，以考察引物探針PCR反應性能。如圖2，單、雙通道結果一致，線性R2＞0.99，引物、探針符合ddPCR檢測要求，且在1個反應孔中進行2種靶基因的擴增不會相互干擾。9#、14#樣品的單、雙通道檢測結果顯示HER2/CEP-17值精密度高（CV分別為2.4%、3.1%）。

2.4 ddPCR檢測結果界定

鑒于293T、HOEC細胞系中HER2/CEP-17值為1.2，結合ddPCR的技術原理，本研究中對標本樣本暫定為：當HER2、CEP-17其中之一拷貝數≥20000時，須降低上樣量重測；在此基礎上，當樣本HER2/CEP-17值≥2.1時為HER2擴增陽性，當樣本2.1＞HER2/CEP-17值≥1.2時為HER2臨界陽性，當樣本HER2/CEP-17值＜1.2時為HER2擴增陰性。

2.5 FISH檢測結果

參照ASCO/CAP公布的2013版HER2檢測指南，本研究根據FISH檢測對HER2CNV的評判標準如下：①當HER2/CEP-17比值≥2.0時，為HER2陽性；HER2/CEP-17比值＜2.0，但平均拷貝數/細胞≥6.0時也為HER2陽性；②若眾多信號連接成簇時可不計算，視為基因擴增；③HER2/CEP-17比值＜2.0且平均拷貝數/細胞＜4.0時為HER2陰性；④HER2/CEP-17比值＜2.0且平均拷貝數/細胞≥4.0但＜6.0，FISH不確定；⑤HER2/CEP-17比值≥2.0，但平均拷貝數/細胞＜4.0的病例是否該視為陽性，目前存在一定爭議。本研究所取樣本的FISH結果均為＞2.0的樣本為陽性，＜2.0的樣本為陰性。關鍵樣本FISH結果如圖3，FISH染色后，用奧林帕斯顯微鏡BX53觀測（目鏡10×，油鏡100×），攝像頭DP70拍照。

2.6 ddPCR、IHC、FISH結果比較

將同一樣品3種檢測平臺所得結果統一比較（表2）。在14例IHC檢測為“++”、FISH檢測小于2.0的樣品中，13例ddPCR檢測陰性，1例（2#）臨界陽性，但該例樣本的FISH檢測結果為1.96，接近FISH的陽性判斷標準。在3例IHC檢測為“+++”、FISH檢測為陽性的樣本中，2例ddPCR檢測為陽性，1例（17#）檢測臨界陽性。還有2例IHC檢測為“++”的樣品，FISH檢測為陽性，但ddPCR檢測為陰性。

圖1 典型CEP-17（A）和HER2（B）ddPCR結果圖

圖2 293T細胞DNA單通道（A）和雙通道（B）檢測結果及HER2/CEP-17值

圖3 典型FISH陰性（A）和陽性（B）結果

表2 IHC、FISH及ddPCR結果比較

3 討論

ddPCR與實時定量PCR技術原理相同，通過酶、引物、探針等對靶基因進行擴增并轉化成可用于定量的數值。與實時定量PCR“一鍋反應”不同的是，ddPCR主要通過微滴生成或芯片將反應體系分成 1×104～2×104個微滴，以形成一個個微小的獨立反應器，數據分析時直接給出每個樣品中靶基因的拷貝數，對于微量拷貝數的定量更為準確。ddPCR與所有PCR實驗一樣，在實驗過程中須嚴格操作，保證環境、樣品不被氣溶膠污染。在ddPCR的引物篩選及條件優化中，我們常選擇陰性、陽性微滴信號分布相對集中且間隔較大情況下對應的體系及程序。同時，數據分析中，需要用陰性對照劃閾值線判定陰、陽性微滴，與實時定量PCR不同的是，ddPCR可結合分析批中陰性對照設置的數量及檢測的結果通過軟件計算出分析批的陽性Cut-off值，只有大于Cut-off值的樣品才真正含有靶基因，小于Cut-off值的樣品為弱陽性/假陽性，陽性微滴的產生可能源于污染或系統誤差等，可選擇重測（主要看實驗者如何設計實驗）。但還需要同時考察樣品陽性微滴所在的信號范圍，如果僅是在閾值線的上方，遠達不到陽性對照樣品中陽性微滴的信號值，則須更加科學地分析這些微滴是否是真的“陽性”。

為對樣品前處理回收率、ddPCR檢測上樣量進行歸一，我們以HER2同一染色體上的CEP-17為對照，采用HER2/CEP-17的形式進行報告，排除切片質量、提取回收效率等因素的干擾。雖然HER2/CEP-17是FISH中HER2檢測的金標準，但我們不能僅依靠CEP-17來判斷17號染色體的數目[8,18-20]。在檢測樣品時，應盡量保證相同的切片數量、處理方法、ddPCR體系和程序，在分析結果的過程中關注CEP-17和HER2各自的拷貝數，及時發現異常，科學地分析數據。本研究ddPCR分析結果表明，在切片數量和DNA上樣量一致的前提下，CEP-17拷貝數變化范圍為幾百至幾千拷貝，說明存在樣本核酸片段化差異顯著情況或者異常擴增的情況。該現象提示我們，ddPCR檢測應用于臨床前需要對FFPE樣品保存和樣本前處理進一步優化，甚至可用新鮮凍存樣本。此外，ddPCR可能需要參比多個內參基因排除CEP-17異常擴增的問題。

本研究中我們檢測了21例樣品，初步得到用ddPCR法檢測HER2CNV（HER2/CEP-17比值）的Cut-off值范圍，并且與FISH陰性樣品的一致性為13/14，陽性結果完全一致性為2/7（其他5例FISH陽性的樣本中，3例ddPCR檢測為臨界陽性，2例為陰性，其FISH檢測結果分別為2.1、2.3）。從上述結果比對中可見，腫瘤的異質性可能導致FISH或ddPCR取樣或結果判讀存在一定的主觀因素，特別是對臨界陽性的樣本。我們仍須繼續增加樣本量，并盡量追蹤FISH檢測與ddPCR檢測不一致的個體的其他檢測結果，甚至后期疾病進展情況，以建立ddPCR從FFPE切片樣品中檢測HER2CNV與IHC進程的參數，成為輔助IHC、FISH用于臨床研究及診斷的檢測手段。