富納米硒沼澤紅假單胞菌的肝保護(hù)作用研究

王越，李保珍，李丹，王蘭

山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006

受環(huán)境污染和密集養(yǎng)殖模式的影響，畜禽養(yǎng)殖中動(dòng)物的肝病發(fā)病率極高，而畜產(chǎn)肉類又是市場(chǎng)上最常見(jiàn)的肉類，因此，減少畜產(chǎn)動(dòng)物肝病的發(fā)病率，尋找合適的畜禽動(dòng)物的護(hù)肝藥物尤為重要。硒是動(dòng)物體必需的營(yíng)養(yǎng)元素，具有多種生物學(xué)功能，包括對(duì)肝臟的保護(hù)作用。由于硒的安全劑量較難把握，故在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用受到了一定的限制。張勁松等[1]利用體外化學(xué)合成的方法制備了紅色納米單質(zhì)硒，這種硒形式具有低毒性、高活性的特點(diǎn)。為了得到高效低毒、制備過(guò)程綠色環(huán)保、價(jià)格低廉的硒產(chǎn)品，利用微生物將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為毒性較低的納米單質(zhì)硒成為目前研究的熱點(diǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn)，多種微生物能夠?qū)單猁}還原為紅色單質(zhì)硒[2-7]。

光合細(xì)菌是地球上最早出現(xiàn)的、具有原始光能合成體系的厭氧原核生物，廣泛存在于地球生物圈，是一種生命力極強(qiáng)的菌體。近年來(lái)，隨著人們對(duì)光合細(xì)菌研究的不斷深入，光合細(xì)菌在畜禽養(yǎng)殖、水產(chǎn)養(yǎng)殖、農(nóng)作物種植及污水治理方面表現(xiàn)出很高的應(yīng)用價(jià)值[8-9]。其中，在我國(guó)沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonaspalustris）已獲準(zhǔn)用作畜禽養(yǎng)殖飼料添加劑生產(chǎn)菌種。研究表明，納米硒（seleniumnanoparticles，SeNPs）具有肝保護(hù)活性[3]。本實(shí)驗(yàn)室前期獲得了一株沼澤紅假單胞菌，能夠?qū)單猁}還原為紅色SeNPs[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)，該生物源SeNPs也具有肝保護(hù)的生物學(xué)效應(yīng)。

鑒于此，在本研究中，我們擬通過(guò)建立四氯化碳（CCl4）小鼠肝損傷模型，探討富納米硒沼澤紅假單胞菌（SeNPs-enrichedR.palustris，SR）對(duì)肝損傷小鼠肝的保護(hù)作用，為開(kāi)發(fā)新的畜禽保肝制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性昆明小鼠，18～22g，90只，清潔級(jí)，購(gòu)于山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。沼澤紅假單胞菌N菌株保藏于山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院[10]。

亞硒酸鈉（分析純），CCl4（分析純），氯化鈉（分析純），蘇木精，二甲苯和植物油等。

1.2 富納米硒沼澤紅假單胞菌的制備

依據(jù)Li等[11]報(bào)道的方法，在亞硒酸鈉添加量為2.0mmol/L、培養(yǎng)基初始pH值為7.0、接種量15%的條件下制備SR菌粉和沼澤紅假單胞菌菌粉，并測(cè)得SR菌粉中含硒量為28.3%[12]。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及肝損傷模型的建立

將90只昆明小鼠于實(shí)驗(yàn)室（溫度18～20℃，光照為12h∶12h）暫養(yǎng)1周，自由飲食。動(dòng)物分組及給藥劑量見(jiàn)表1。

對(duì)照（Control）組和模型（Model）組小鼠灌胃生理鹽水，其他組小鼠灌胃相應(yīng)劑量的SR菌液和沼澤紅假單胞菌菌液，連續(xù)給藥14d后，禁食不禁水24h，第15dControl組和H-SRControl組一次性腹腔注射植物油10mL/kg，其他組一次性腹腔注射1%的CCl410mL/kg，24h后處死小鼠取材。

表1 SeNPs對(duì)小鼠肝損傷保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥劑量

1.4 取材

將每只小鼠稱重后，立即解剖取肝臟，用冷的PBS反復(fù)沖洗，用濾紙吸干水分，稱重。其中，每組隨機(jī)選取2只小鼠解剖取肝臟，PBS沖洗后迅速拍照，在肝臟右葉距邊緣0.5cm處取1cm×0.2cm×0.2cm的肝組織，置10%甲醛中固定。

1.5 觀察手段

1.5.1 體視顯微鏡觀察肝組織整體形態(tài) 取出新鮮的肝組織置于培養(yǎng)皿中，用PBS沖洗后浸泡在PBS中，于體視顯微鏡下觀察肝組織外部形態(tài)。

1.5.2 光鏡觀察組織細(xì)胞切片 從甲醛固定液中取出肝組織，流水沖洗過(guò)夜，分別置于50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇中脫水，二甲苯透明，石蠟包埋；在Leica石蠟切片機(jī)（RM2255）上連續(xù)切片，厚度6μm；切片經(jīng)脫蠟和水化后用蒸餾水清洗，HE染色，觀察組織的病理學(xué)變化[13]。

1.5.3 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以x±s表示。采用Origin8.5軟件制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)小鼠觀察

Control組小鼠皮毛光澤，活動(dòng)正常，飲食正常，二便正常；SR各劑量組及R.palustris各劑量組小鼠皮毛光澤鮮亮，行動(dòng)敏捷，較為活潑，正常飲食，二便正常。但是，注射CCl4后，各組小鼠出現(xiàn)不同程度的精神萎靡、反應(yīng)遲鈍現(xiàn)象。Model組小鼠外表變化最明顯，皮毛粗糙凌亂，毛色發(fā)暗，大便稀軟，表明CCl4對(duì)機(jī)體產(chǎn)生很大的損傷作用。R.palustris各劑量組與Model組的小鼠表現(xiàn)相似，SR各劑量組較Model組的小鼠活潑且皮毛較順，表明SR對(duì)小鼠具有一定的保護(hù)作用。

2.2 富納米硒沼澤紅假單胞菌對(duì)肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響

肝臟指數(shù)是肝損傷的指標(biāo)之一，能夠反映肝組織腫脹程度和炎性浸潤(rùn)。CCl4肝損傷通常能夠?qū)е赂渭?xì)胞腫大、氣球樣變等，這些癥狀會(huì)使得肝組織重量增加，即肝臟指數(shù)增大[14]。由圖1可知，H-SRControl組與Control組小鼠肝臟指數(shù)相比差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中最大劑量SR不會(huì)導(dǎo)致小鼠肝臟指數(shù)增大，對(duì)小鼠沒(méi)有明顯的損傷。Model組與Control組小鼠肝臟指數(shù)相比明顯升高，呈極顯著性差異（P＜0.01），表明CCl4處理后小鼠肝臟損傷明顯。R.palustris的3個(gè)劑量組和L-SR組與Model組肝臟指數(shù)相比均差異不顯著（P＞0.05），而當(dāng) SR 菌液中含硒為 100和 200 μg/kg時(shí)，肝臟指數(shù)降低，分別與Model組相比呈顯著或極顯著差異（P＜0.05，P＜0.01），表明 SR能夠抑制炎癥反應(yīng)所致的肝臟重量增加和體積增大，具有一定的抗炎和抗急性肝損傷的作用，而沼澤紅假單胞菌幾乎沒(méi)有相應(yīng)的保護(hù)作用。這一結(jié)果與一些化學(xué)方法合成的SeNPs的研究相一致[15-17]。

2.3 富納米硒沼澤紅假單胞菌對(duì)肝損傷小鼠肝臟形態(tài)的影響

實(shí)體解剖鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Control組（圖2，A列）小鼠肝臟表面顏色略呈深紅色，光澤度好，表面光滑，質(zhì)地柔軟，觸感新鮮，邊緣整齊，切割較順暢。H-SRControl組（圖2，C列）小鼠肝臟形態(tài)與Control組基本一致。Model組（圖2，B列）小鼠顏色發(fā)灰，色澤較暗，表面較鈍，質(zhì)地發(fā)硬，邊緣不整齊，切割時(shí)阻力較大，在肝臟表面可看到出血點(diǎn)。3個(gè)劑量的R.palustris處理組（圖2，D～F列）出血點(diǎn)較深，與Model組情況基本相似。不同劑量SR組（圖2，G～I(xiàn)列）出血點(diǎn)癥狀減輕，表明SR能夠緩解CCl4肝損傷小鼠肝臟表面出血點(diǎn)。

2.4 富納米硒沼澤紅假單胞菌對(duì)肝損傷小鼠肝組織細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的影響

Control組（圖3A）小鼠肝組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞索排列規(guī)則，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚；肝細(xì)胞形態(tài)正常，呈多邊形，細(xì)胞核居中，核仁清晰，肝血竇及匯管區(qū)無(wú)異常，無(wú)細(xì)胞水腫、壞死和炎細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。Model組（圖3B）肝小葉邊界不清晰，肝細(xì)胞索紊亂，中央靜脈腔周?chē)笃瑝乃狼矣写罅垦准?xì)胞浸潤(rùn)；細(xì)胞體積增大，水腫較為明顯，胞漿不勻，細(xì)胞出現(xiàn)疏松化、氣球樣變，出現(xiàn)中性粒細(xì)胞，并且有大量核固縮現(xiàn)象。H-SRControl組（圖3C）肝細(xì)胞索排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞形態(tài)基本正常。3個(gè)R.palustris組（圖3D～F）有不同程度的變化，如肝小葉邊界不清晰，肝細(xì)胞索紊亂，細(xì)胞壞死，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞水腫，細(xì)胞體積增大，胞漿不勻，細(xì)胞疏松化。L-SR組（圖3G）肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)中央靜脈腔周?chē)屑?xì)胞壞死現(xiàn)象，但壞死區(qū)域較模型組小，炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，依然有細(xì)胞水腫、細(xì)胞體積增大、細(xì)胞疏松化的現(xiàn)象。M-SR組（圖3H）觀察到肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)，肝小葉邊界開(kāi)始變得清晰，胞質(zhì)變得均勻，中央靜脈腔周?chē)鷥H有點(diǎn)狀壞死，有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞水腫較輕。H-SR組（圖3I）肝小葉邊界較為清晰，肝細(xì)胞索排列基本正常，肝細(xì)胞質(zhì)較為均勻，基本看不到疏松化，也沒(méi)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，僅中央靜脈腔周?chē)⒃邳c(diǎn)狀壞死，有輕微細(xì)胞水腫現(xiàn)象。組織病理學(xué)檢測(cè)表明，SeNPs能夠在組織水平上減輕肝細(xì)胞壞死、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞疏松化、細(xì)胞水腫等病理癥狀。由此推斷，SR在組織細(xì)胞水平上對(duì)CCl4所致肝損傷小鼠有保護(hù)作用。

圖1 SR對(duì)急性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響

圖2 昆明小鼠實(shí)體解剖結(jié)構(gòu)觀察

圖3 昆明小鼠肝組織細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)觀察（HE染色，400×）

2.5 小結(jié)

綜上所述，SR在含硒量為200μg/kg時(shí)對(duì)小鼠肝臟無(wú)毒害作用，而且能夠降低肝損傷導(dǎo)致的肝臟指數(shù)，減少肝細(xì)胞壞死、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、氣球樣變等病理變化，并具有保肝作用。本研究為利用沼澤紅假單胞菌生產(chǎn)富納米硒制劑，并應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖的肝保護(hù)提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)