海南黃芩中黃酮類化合物的分離與鑒定

劉潔，李備，劉春，陳露，梁揚(yáng)，周玦飛，顏彥，陳贊民

1.海南省藥品檢驗(yàn)所，海南 海口 570216；2.海南省食品檢驗(yàn)檢測中心，海南 海口 570311

唇形科（Labiatae）黃芩屬（Scutellaria）植物資源十分豐富，全世界共有300余種。該屬物種多具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效[1-2]。黃芩屬植物具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤、保肝、抗氧化等活性。現(xiàn)代化學(xué)成分研究表明，黃酮和二萜為其主要活性成分[3]。近十幾年，有大量研究對從黃芩屬植物中所得化學(xué)成分的活性進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)了許多結(jié)構(gòu)新穎且活性顯著的化合物。海南黃芩（S.hainanensis）為唇形科黃芩屬植物，分布于海南地區(qū)，長于石山上，是海南特有植物，具有清熱解毒的功效[4]。迄今，有關(guān)海南黃芩化學(xué)成分研究的報(bào)道較少。在此，我們利用多種提取分離技術(shù)研究海南黃芩中的化學(xué)成分，并利用波譜學(xué)方法對所得化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，從海南黃芩中得到5種黃酮類化合物。

1 材料與方法

1.1 材料

所用植物于2014年8月采自海南省霸王嶺，經(jīng)鑒定為海南黃芩。

BrukerAVⅢ600型核磁共振儀；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵（河南鞏義英峪予華儀器廠）；超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；島津LC-10AD二元低壓半制備液相色譜儀；Agilent半制備色譜柱（Phenyl，2.5mm × 25.0cm，5 μm）；島津20A高效液相色譜儀；薄層色譜預(yù)制板、柱色譜硅膠（100～200目，200～300目，青島海洋化工廠）；SephadexLH-20（Healthcare公 司），HICHROM ApolloC18色譜柱（250mm × 4.6mm，5 μm）。

綜上，微創(chuàng)低溫等離子射頻消融術(shù)聯(lián)合低劑量放療能縮短手術(shù)時(shí)間，減少并發(fā)癥，降低復(fù)發(fā)率，促進(jìn)患者發(fā)聲功能恢復(fù)，提高術(shù)后生活質(zhì)量，值得應(yīng)用。

1.2 提取黃酮類化合物

干燥粉碎后的海南黃芩（5kg）用95%乙醇（20L）冷浸24h，然后采用加熱回流進(jìn)行提取。共提取3次，每次2h；減壓回收溶劑，直至乙醇味消失；母液加水后，用石油醚萃取，繼而采用氯仿萃取，濃縮后得到50g浸膏。

1.3 分離純化黃酮類化合物

將氯仿萃取物進(jìn)行硅膠柱色譜分析，用氯仿-丙酮梯度洗脫，合并后得到洗脫物Fr.A、Fr.B和Fr.C。Fr.B用硅膠柱色譜分離后，再進(jìn)行凝膠柱色譜分離，采用反相高效液相制備色譜進(jìn)行分離，得到化合物 1（12.0mg）、3（18mg）、5（23.0 mg）；Fr.C通過硅膠柱色譜、凝膠柱色譜、反相高效液相制備色譜得化合物2（10mg）、4（9.0mg）。

1.4 測定黃酮類化合物純度

稱取5種化合物各約2mg，精密稱定，分別至100mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，即得供試品。

色譜條件：HICHROMApolloC18色譜柱（250 mm × 4.6mm，5μm），流動(dòng)相A為0.3%磷酸，流動(dòng)相B為甲醇∶乙腈=2∶3，流動(dòng)相A∶流動(dòng)相B=40∶60；流速1.0mL/min，柱溫 35℃，進(jìn)樣量 20 μL，檢測波長280nm。

1.5 核磁測定方法

采用BrukerAVⅢ600型核磁共振儀，化合物1 溶劑為 CDCl3，化合物 2～5 溶劑為 DMSO-d6，1H-NMR為600MHz，13C-NMR為150MHz。

2 結(jié)果

2.1 化合物1結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為無色油狀物，HPLC歸一化法測得純度為 98.2%（圖 1）。根據(jù)其1H-NMR（CDCl3，600 MHz）譜（圖2），推斷δ：12.20（5-OH），7.31（1H，t，J=8.4Hz，H-4′），6.60（2H，d，J=8.4Hz，H-3′，5′），6.08（1H，s，H-6），6.07（1H，dd，J=13.2，4.8Hz，H-2），3.88（3H，s，-OCH3），3.86（1H，dd，J=17.2，13.2Hz，H-3a），3.81（6H，s，2′，6′-OCH3），3.70（3H，s，-OCH3），2.56（1H，dd，J=17.2，4.8Hz，H-3b）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道的 5-羥基-7，8，2′，6′-四甲氧基二氫黃酮基本一致，故確定化合物1為5-羥基-7，8，2′，6′-四甲氧基二氫黃酮。

2.2 化合物2結(jié)構(gòu)鑒定

化合物2呈無色針晶狀（甲醇），HPLC歸一化法測得純度為97.5%（圖3）。根據(jù)其1H-NMR（DMSO-d6，600MHz）譜（圖4），推斷δ：12.50（1H，s，5-OH），7.86（1H，dd，J=8.4，2.4Hz，H-6′），7.61（1H，t，J=8.4 Hz，H-4′），7.26（1H，d，J=8.4Hz，H-3′），7.18（1H，t，J=8.4Hz，H-5′），6.76（1H，s，H-3），6.20（1H，s，H-8），3.91（3H，s，7-OCH3）。根據(jù)其13C-NMR（DMSO-d6，150MHz）譜（圖5），推斷δ：181.4（C-4），100.1（C-8），105.0（C-10），109.7（C-3），115.0（C-3′），120.4（C-1′），121.3（C-5′），128.7（C-4′），129.4（C-6′），133.6（C-6），150.2（C-7），156.8（C-2，C-2′），158.1（C-5），56.4（7-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道的5，6，7-三羥基-2′-甲氧基黃酮基本一致，故確定化合物2為5，6，7-三羥基-2′-甲氧基黃酮。

2.3 化合物3結(jié)構(gòu)鑒定

化合物3為無色油狀物，HPLC歸一化法測得純度為98.0%（圖6）。根據(jù)其1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）譜（圖7），推斷δ：12.50（1H，s，5-OH），7.86（1H，dd，J=8.4，2.4Hz，H-6′），7.61（1H，t，J=8.4Hz，H-4′），7.26（1H，d，J=8.4Hz，H-3′），7.18（1H，t，J=8.4 Hz，H-5′），6.76（1H，s，H-3），6.20（1H，s，H-8），3.91（3H，s，7-OCH3），3.79（3H，s，2′-OCH3）。根據(jù)其13CNMR（DMSO-d6，150MHz）譜（圖8），推斷δ：181.4（C-4），100.1（C-8），105.0（C-10），109.8（C-3），115.0（C-3′），120.2（C-1′），121.3（C-5′），126.7（C-5′），129.4（C-6′），133.5（C-6），150.1（C-7），156.7（C-2，C-2′），158.1（C-5），56.4（7-OCH3），61.2（2′-OCH3）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的5，2′-二羥基-6，7-二甲氧基黃酮基本一致，故確定化合物3為5，2′-二羥基-6，7-二甲氧基黃酮。

圖1化合物1純度測定液相色譜圖

圖2化合物1的1H-NMR譜

圖3 化合物2純度測定液相色譜圖

2.4 化合物4結(jié)構(gòu)鑒定

化合物4為無色油狀物，HPLC歸一化法測得純度為 97.1%（圖 9）。根據(jù)其1H-NMR（600MHz，DMSO-d6）譜（圖10），推斷δ：13.00（1H，s，5-OH），7.92（2H，t，J=8.4Hz，H-2′，6′），7.52（3H，m，H-3′，4′，5′），6.50（1H，s，H-3），6.24（1H，s，H-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的黃芩素基本一致，故確定化合物4為黃芩素。

2.5 化合物5結(jié)構(gòu)鑒定

化合物5呈無色片晶狀，HPLC歸一化法測得純度為95.8%（圖11）。根據(jù)其1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）譜（圖12），推斷δ：12.50（1H，s，5-OH），8.08（1H，d，J=15.6Hz，H-7），7.61（3H，m，H-3′，4′，5′），6.80（1H，s，H-3），6.29（1H，s，H-8），3.81（3H，s，7-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的黃芩素7-甲醚基本一致，故確定化合物5為黃芩素7-甲醚。

圖4 化合物2的1H-NMR譜

圖5 化合物2的13C-NMR譜

圖6 化合物3純度測定液相色譜圖

3 討論

我們采用多種提取分離技術(shù)，并利用波譜學(xué)方法對所得結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，首次從海南黃芩中得到5種黃酮類化合物，分別鑒定為5-羥基-7，8，2′，6′-四甲氧基二氫黃酮（為多甲氧基二氫黃酮）、5，6，7-三羥基-2′-甲氧基黃酮、5，6-二羥基-7，2′-二甲氧基黃酮、黃芩素和黃芩素-7甲醚。這些化合物的獲得豐富了海南黃芩化學(xué)成分組成，為其深入研究與開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

圖7 化合物3的1H-NMR譜

圖8 化合物3的13C-NMR譜

圖9 化合物4純度測定液相色譜圖

圖10 化合物4的1H-NMR譜

圖11 化合物5純度測定液相色譜圖

圖12 化合物5的1H-NMR譜