人源性乙酰膽堿受體α亞基胞外肽段的原核表達與血清學診斷研究

許勝杰，孫衛國，陳玉萍，王中魁，陶曉勇，王衛

解放軍第三〇九醫院 a.神經內科；b.全軍結核病防治重點實驗室，結核病診療新技術北京市重點實驗室；北京 100091

重癥肌無力（myastheniagravis，MG）是一種自身免疫性疾病，機制為血清中大量生成的乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AchR）抗體與AchR結合，導致AchR生理功能低下，引發肌肉疲乏無力癥狀[1]。目前在我國人群中MG發病率較高，早發現及時治療對改善預后具有重要意義。研究表明，血清中AchR抗體滴度與MG的病情密切相關，通過檢測患者血清中AchR抗體水平可以對MG患者進行初步臨床診斷和病情評估。神經肌肉接頭處突觸后膜的AchR是一個由4種亞基構成的五聚體跨膜蛋白，其中α亞基上存在眾多抗原表位，AchR特異性T細胞及B細胞表位幾乎均存在于α亞基上，α亞基有望作為抗原用來檢測MG患者血清AchR抗體[2]。α亞基是一個具有4個跨膜區域的跨膜蛋白，其胞外域可用于免疫吸附、免疫動物制備實驗性重癥肌無力動物模型。我們構建了AchR的α亞基胞外氨基酸即第1～221位氨基酸（aa）序列的融合表達載體pETNusA-AchR-α，原核表達獲得融合蛋白NusAAchR-α，純化重組蛋白后進行血清學鑒定，對重組蛋白用于MG患者血清學診斷的價值進行評估，探討開發臨床檢測MG試劑盒的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

臨床陽性血清來自本院神經內科住院MG患者200例；健康人血清來自本院體檢中心60例；大腸桿菌BL21（DE3）、質粒pET-NusA由本室保存；全基因和引物由華大基因公司合成；限制性內切酶HindⅢ和XhoⅠ、T4DNA連接酶購自NEB公司；TaqDNA聚合酶和dNTP購自天根生化生物公司；HRP酶標羊抗人IgG購自華美生物技術公司；瓊脂糖為Spain公司產品；IPTG為Merck公司產品；蛋白質相對分子質量marker為Sigma公司產品；其他試劑為進口或國產分析純產品。

在這個例句中，根據句義“the man to help you”可以理解為“the man who helps you”。因此，the man與help構成了主謂關系。

1.2 全基因與引物合成

全合成α亞基胞外氨基酸序列對應的核酸序列（GenBank：M64695），在上、下游 5′和 3′端分別引入HindⅢ酶切位點（AAGCTT）和XhoⅠ酶切位點（CTCGAG），在 3′端引入原核終止密碼子TAA。合成全序列為：

aagcttTCCGAACATGAGACCCGTCTGGTGGCAAAGCTATTTAA AGACTACAGCAGCGTGGTGCGGCCAGTGGAAGACCACCGCCAGG TCGTGGAGGTCACCGTGGGCCTGCAGCTGATACAGCTCATCAAT GTGGATGAAGTAAATCAGATCGTGACAACCAATGTGCGTCTGAA ACAGCAATGGGTGGATTACAACCTAAAATGGAATCCAGATGACT ATGGCGGTGTGAAAAAAATTCACATTCCTTCAGAAAAGATCTGG CGCCCAGACCTTGTTCTCTATAACAATGCAGATGGTGACTTTGC TATTGTCAAGTTCACCAAAGTGCTCCTGCAGTACACTGGCCACA TCACGTGGACACCTCCAGCCATCTTTAAAAGCTACTGTGAGATC ATCGTCACCCACTTTCCCTTTGATGAACAGAACTGCAGCATGAA GCTGGGCACCTGGACCTACGACGGCTCTGTCGTGGCCATCAACC CGGAAAGCGACCAGCCAGACCTGAGCAACTTCATGGAGAGCGCC CCGACACCCCCTACCTGGACATCACCTACCACTTCGTCATGCAG CGCCTGTAActcgag

合成的陽性鑒定引物為：

正向 5′-CCCaagcttTCCGAACATGAGACCCGTCT-3′

反向 5′-CCGctcgagTTACAGGCGCTGCATGACGAAGTGG-3′

1.3 pET-NusA-AchR-α重組質粒的構建

合成的序列及表達載體pET-NusA分別用HindⅢ和XhoⅠ雙酶切后切膠回收，回收后的產物按濃度比3∶1過夜連接，連接產物轉化感受態大腸桿菌BL21（DE3），篩選PCR陽性菌落進行測序，獲得工程菌pET-NusA-AchR-α。

1.4 NusA-AchR-α融合蛋白的原核表達

將陽性工程菌株轉接至含卡那霉素的LB培養基中，于37℃振蕩活化，擴大培養中檢測細菌菌液D600nm值為0.4時加入IPTG（終濃度0.3mmol/L），37℃繼續誘導7h，離心收集菌體，在冰浴狀態下進行超聲波破碎，高速離心（12000r/min，30min），取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。

1.5 NusA-AchR-α融合蛋白的純化

取超聲波破碎后上清，加入咪唑至終濃度為10mmol/L，充分混勻，通過鎳離子螯合的親和層析柱對目的蛋白進行親和純化，分別以30mmol/L咪唑除去菌體自身蛋白、150mmol/L咪唑洗脫收集目的融合蛋白，通過12%SDS-PAGE分析純化后目的蛋白的純度。

1.6 NusA-AchR-α融合蛋白的免疫印跡與ELISA分析

取NusA-AchR-α融合蛋白凍干粉末，用PBS緩沖液稀釋成1mg/mL的母液，吸取2μL加入上樣緩沖液煮沸8min，經12%SDS-PAGE后轉移到硝酸纖維素膜上，用5%的脫脂奶粉封閉后，依次以確診陽性MG患者血清、HRP標記的羊抗人IgG孵育，漂洗干凈，通過ECL進行暗室自動曝光顯影，分析重組蛋白的抗原性。

用碳酸鈉溶液將融合蛋白稀釋至4μg/mL備用，酶標板包被過夜后，37℃封閉2h，用PBST充分洗板5次，確診MG患者血清和健康人血清（1∶200）于37℃孵育1h，重新洗板若干次，每孔中加入用PBS稀釋至1∶1000的HRP標記的羊抗人IgG100 μL，37℃振蕩孵育1h，再洗板 5次，加入TMB顯色液反應30min顯色，終止反應，酶標儀檢測D450nm值，結果判定以待測樣本的D450nm值與陰性對照的D450nm值之比≥210（P/N≥210）為陽性，顯示陽性結果的最大抗體稀釋度為血清效價。

2 結果

2.1 pET-NusA-AchR-α表達載體的構建

通過全基因合成的方法獲得AchRα胞外肽段核酸全序列，克隆到載體pET-NusA中，以合成的引物通過菌落PCR篩選陽性克隆進行測序保存。PCR產物的1%瓊脂糖電泳結果見圖1，在約660bp處有單一的條帶，和預期結果一致。

2.2 NusA-AchR-α融合蛋白的表達與純化

NusA-AchR-α融合蛋白的相對分子質量約為80000（圖2），與預期一致，目的蛋白的表達量占細菌總蛋白的25%～35%。SDS-PAGE分析表明重組蛋白主要表達于上清中，這同理論結果相同。前期實驗中，我們嘗試將AchRα亞基胞外段用pET-22b載體進行非融合表達，但沒有獲得成功。

圖1 AchRα胞外肽段核酸PCR產物的凝膠電泳鑒定

對重組 NusA-AchR-α表達后的上清液進行親和柱純化，SDS-PAGE分析純化結果，重組蛋白純度可達90%以上（圖3）。

2.3 NusA-AchR-α融合蛋白的Western印跡鑒定

以確診的MG患者血清為一抗與NC膜進行孵育，Western印跡表明融合蛋白NusA-AchR-α與MG患者血清結合，在膠片上顯示出條帶（圖4）。而對照的NusA蛋白在對應位置沒有出現條帶。實驗說明，純化后的重組蛋白NusA-AchR-α相對于MG患者血清具有強的抗原性及特異性。

2.4 融合蛋白NusA-AchR-α的ELISA鑒定

收集200份MG患者血清和100份健康人血清對純化的NusA-AchR-α重組蛋白進行ELISA分析，發現常規ELISA最佳重組抗原包被濃度為4μg/mL，96孔包被板背景較深，非特異結合較強，其中MG患者檢出120例，檢出率為60%；健康人血清檢出5例，特異度為95%。

圖2 pET-NusA-AchR-α原核表達產物的SDS-PAGE

圖3 NusA-AchR-α親和純化的SDS-PAGE分析

圖4 NusA-AchR-α和MG患者血清的Western印跡抗原性分析

3 討論

在MG患者發病過程中有多種抗體參與[3]，我院神經內科研究發現MG患者的患病程度與Titin抗體濃度呈正相關[4]。劉嵐劍等[5]研究發現，MG患者血清AchR抗體和Titin抗體陽性率均明顯高于對照組，AchR抗體與Titin抗體檢測重癥肌無力的敏感度分別為76.3%和52.5%，2種抗體并聯后敏感度可提高到86.3%。通過檢測患者血清AchR抗體水平，可以初步預判MG癥狀，目前國內市場還沒有血清學檢測MG疾病的試劑，臨床檢測主要依賴國外進口試劑盒。為了對AchR抗體進行血清學檢測，我們嘗試對AchR的α亞基胞外段進行體外重組。同時，參考NusA蛋白標簽系統能顯著提高外源蛋白的可溶性表達功能，并且NusA標簽還能使目的蛋白仍保持正確折疊和生物學活性的作用，將AchR-α與NusA進行融合表達，獲得了重組NusA-AchR-α的可溶性表達，在后期的ELISA實驗中，由于顯色背景較深，陽性檢出率不是很理想，但相對于對照血清而言還是能初步進行甄別。后期實驗我們將對AchR序列進行抗原優化以提高特異性。本實驗為開發MG臨床血清學診斷研究做了初步嘗試，也能為今后開發血清學檢測試劑盒提供參考。