人血小板衍生生長因子BB亞型包涵體復性與純化

孫衛國，鄭本獻，熊志紅，楊秉芬，劉艷華，張靈霞

1.解放軍第309醫院 結核病研究所，全軍結核病防治重點實驗室，結核病診療新技術北京市重點實驗室，北京 100091；2.軍事科學院 第61研究所門診部，北京 100141

血小板衍生生長因子（platelet-derived growth?factor，PDGF）是由細胞產生的肽類生長因子，與受體結合后，通過Ras/GTP激活絲裂原活化蛋白激酶信號通路，促進細胞的有絲分裂[1]。PDGF參與機體組織的生長發育、創傷愈合，腫瘤的發生、發展及動脈粥樣硬化等[2]。在PDGF所有亞型中，PDGF-BB行使PDGF的主要功能，在創傷愈合的各個階段發揮重要作用[3]。PDGF-BB能加速成骨細胞內的DNA合成與修復，刺激成骨細胞的復制和膠原降解，從而促進骨折造成的創傷愈合[4]。目前利用原核表達系統規模化生產PDGF-BB細胞因子的主要困難是表達量非常低，復性率不高，純化條件不穩定，生物活性也不高。本實驗室根據原核表達特點，參照生物信息學和軟件Vector NTI suitor7.0分析結果，提高了PDGF-BB的表達量，占菌體總蛋白的25%[5]。在此，我們對基因工程下游技術進行探索，對PDGF-BB包涵體的變性、復性方法和條件，以及純化工藝的優化進行多次嘗試，提高了PDGF-BB包涵體的復性率達40%以上，同時穩定了重組蛋白的純化工藝，獲得了純度大于95%且具有良好生物活性的重組PDGF-BB蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

NIH3T3細胞株、宿主菌株大腸桿菌BL21（DE3）、表達載體pET-PGDF-BB由本室保存。酵母提取物、胰蛋白胨購自Oxoid公司；PDGF-BB標準品購自中國藥品生物制品檢定所；PDGF-BB抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標羊抗兔IgG購自Ab?cam公司；層析用填料SP SepharoseFF、分子篩填料Sephacryl S300購自GE公司；FPLC蛋白純化分離系統購自Bio-Rad公司；其他生化試劑均為國產分析純產品。

1.2 PGDF-BB重組蛋白的原核高表達

通過生物信息學分析，參照生物軟件對PGDF-BB編碼序列按照同義密碼子原則進行置換優化，設計合成了PDGF-BB全長序列，3′端終止密碼為TAA，構建了原核表達載體pET-PGDFBB，工程菌接種含卡那霉素的LB培養基，37℃振搖培養，當菌液D600nm值達0.5時，加入IPTG至終濃度為0.2mmol/L，37℃誘導表達7h，離心收集沉淀菌體，加入 50mmolTris-HCl（pH8.0）緩沖液，4℃條件下超聲波破碎，SDS-PAGE分析蛋白的表達量。

1.3 重組PGDF-BB蛋白包涵體洗滌溶解與初步純化

包涵體的初步洗滌對包涵體的復性極其重要，可將菌體的外膜蛋白、核酸、質粒DNA等雜質除去，避免影響隨后的復性過程。為了增加去垢劑洗滌能力，可在洗滌緩沖液（50mmol/LNaCl，50mmol/LTris，1mmol/LEDTA，0.5% Triton-X100+梯度尿素）內加入一定濃度的鹽離子。洗滌后的包涵體用8mol/L尿素加2%巰基乙醇緩沖液充分溶解后，上樣分子篩層析柱Sephacryl S300，收集紫外檢測下各分離蛋白峰進行SDSPAGE，分析初步純化后包涵體溶液的純度。

1.4 PGDF-BB包涵體復性與再純化

PDGF-BB成熟肽是由2個相同的單體蛋白PDGF-B通過二硫鍵形成的同型二聚體。相對單體蛋白而言，多聚體蛋白因為分子間與分子內二硫鍵容易錯配導致復性比較困難，針對不同蛋白需要摸索不同的復性方法。稀釋復性是將變性蛋白質溶液直接加入復性緩沖液中，降低單位體積內的變性蛋白濃度，減少錯配幾率，適合多聚體蛋白的復性，因而是一種更簡單和快速的方法。收集經初步分子篩純化的包涵體上清液，以1∶100的比例和4mL/h的速度滴加稀釋到pH6.0的復性液（25mmol/LTris-Cl，0.1mmol/LNaCl，0.5mmol/L EDTA，4mol/L尿 素 ，0.1mmol/L GSSG，0.2mmol/LGSH，1%甘油）中，4℃放置24 h左右，取復性液按1∶10的比例置入pH6.0的透析 液（25mmol/L Tris-Cl，0.1mmolNaCl，0.5 mmol/LEDTA，2mol/L尿素，0.1mmol/LGSSG，0.2mmol/LGSH）中透析，10h換透析液一次，依次降低尿素濃度至1、0.5、0mol/L，高速離心除去沉淀。取上清液上樣SPSepharoseFF陽離子交換 柱 ，用 0.2 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-Cl（pH6.0）的緩沖液沖洗雜蛋白，用0.5mol/L NaCl、20mmol/LTris-Cl（pH7.4）的緩沖液洗脫目的蛋白；收集目的蛋白，SDS-PAGE分析經復性純化后重組PGDF-BB蛋白的純度。

1.5 重組PDGF-BB蛋白的Western印跡鑒定與活性測定

取純化的PDGF-BB蛋白進行14%的SDSPAGE，半干法轉移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉于37℃封閉1h，兔抗人PDGF-BB抗體于4℃孵育過夜，PBST緩沖液洗滌3次后，室溫條件下與HRP標記的羊抗兔IgG結合2h，PBST緩沖液洗滌4次，每次5min，ECL暗室自動曝光顯影驗證重組蛋白的抗原性。

將培養的對數期NIH3T3細胞以含10%小牛血清的DMEM調成細胞懸液，按1×104/孔傳入96孔板，37℃孵箱中培養48h，更換成含0.5%胎牛血清的DMEM培養基繼續培養24h，依次加入用維持培養液稀釋的重組蛋白和對照標準品PDGF-BB，每濃度梯度做3個平行孔，37℃、5%CO2條件下培養72h，MTT法檢測各孔的D490nm值，繪制對應的D490nm值與PDGF-BB濃度曲線。

2 結果

2.1 PGDF-BB重組蛋白的原核高表達

參照生物信息學和生物軟件分析，合成PGDF-BB編碼序列，克隆構建原核表達載體pET-PGDF-BB，重組菌經IPTG誘導表達7h，收集菌體超聲波破碎，SDS-PAGE分析結果，圖1箭頭示重組蛋白，編碼核酸經過優化后，重組蛋白表達水平明顯提高，表達量從優化前的10%（4泳道）上升到25%左右（1、2泳道）。超聲波破碎后，重組蛋白以包涵體的形式存在于菌體沉淀中。

2.2 PGDF-BB包涵體洗滌溶解與分子篩層析純化

包涵體用 50mmol/LNaCl、50mmol/LTris、1mmol/LEDTA、0.5%Triton-X100洗滌2次，離心收集上清進行電泳分析，洗滌后的包涵體分別用2、4、8mol/L尿素加2%巰基乙醇緩沖液充分溶解，離心收集上清進行包涵體溶解度檢測，實驗結果如圖2，經過3次0.5%Triton-X100洗滌后，上清中沒有目的蛋白出現，大多數雜蛋白被除去，包涵體得到富集。梯度尿素溶解后發現包涵體只能溶解在8mol/L尿素中，這為后續大規模純化帶來方便。

圖1 PGDF-BB優化序列誘導后的全菌體蛋白SDS-PAGE分析

包涵體用8mol/L尿素加2%巰基乙醇充分溶解，高速離心收集上清上樣過分子篩層析柱Sep?hacrylS300，FPLC檢測各分離蛋白峰，SDS-PAGE分析經初步純化后包涵體溶液的純度，結果見圖3、4，包涵體溶液得到部分富集。

2.3 PGDF-BB包涵體復性與離子交換層析

分別采用透析、稀釋和滴加復性的方法對PGDF-BB包涵體復性，比較實驗結果發現滴加復性相對其他方法而言可以獲得更高的復性率。滴加復性的方法更適合含有較多分子間或分子內二硫鍵的多聚體蛋白，滴加樣品的速度和復性液的組成都會影響最終的復性率。為了便于后續陽離子交換層析，將復性液的pH值設置為6.0左右，復性液的組成為25mmol/LTris-Cl、0.1 mmol/LNaCl、0.5mmol/LEDTA、4mol/L 尿 素（pH6.0）、0.1mmol/LGSSG、0.2mmol/LGSH，1%甘油。滴加復性后PDGF-BB的復性率在40%以上，復性后溶液高速離心，取上清進行SDS-PAGE分析，結果見圖5。

圖2 PDGF-BB包涵體洗滌、尿素溶解的SDS-PAGE分析

圖3 PDGF-BB包涵體溶液SephacrylS300層析液的UV檢測

圖4 PDGF-BB包涵體溶液SephacrylS300層析液的SDS-PAGE 1：上樣前；M：蛋白marker；2：出峰前收集液；

參照PDGF-BB的理化特性，采用陽離子交換層析對復性后的溶液進行二次純化，用0.2mol/LNaCl洗去雜蛋白，0.5mol/LNaCl、20mmol/L Tris-Cl（pH7.4）緩沖液洗脫目的蛋白峰，收集目的蛋白進行SDS-PAGE，分析純化后重組PGDF-BB蛋白的純度。結果如圖6、7，經分子篩和離子交換層析后，重組蛋白的純度可達95%以上。

2.4 重組PDGF-BB蛋白的Western印跡與活性測定結果

圖5 PDGF-BB包涵體復性后的SDS-PAGE

圖6 PDGF-BB包涵體復性液SPSepharoseFF層析UV檢測

以PDGF-BB標準品為陽性對照、PBS為陰性對照，純化的PDGF-BB蛋白分別與兔抗人PDGFBB一抗和羊抗兔IgG-HRP二抗進行孵育、洗滌和暗室曝光，Western印跡結果表明純化的重組蛋白能與hPDGF-BB抗體結合，具有強的抗原性。

MTT方法驗證重組蛋白的生物活性，以PDGF-BB標準品為陽性對照，制作D490nm值與PDGF-BB濃度曲線，發現獲得的重組蛋白具有良好的生物活性，對NIH3T3細胞具有明顯的促增殖作用，與標準品表現出一致性，兩者在統計學分析上無差異。

3 討論

PDGF-BB具有多種生物學功能，含0.01%重組人PDGF-BB的羧甲基纖維素鈉膠（NaCMC）已在美國獲準用于遠端神經性糖尿病潰瘍的治療。在PDGF所有亞型中，PDGF-BB的功能如促進創傷愈合、骨組織修復和重建作用已得到肯定。目前利用原核系統生產重組人PDGF-BB蛋白受制于表達量低、復性困難而無法大規模生產。本研究參照生物軟件分析，從生物信息學角度對其mRNA序列進行同義密碼子置換，獲得了PDGF-BB在原核系統內的高表達，明顯優于優化前的水平。同時，對PDGF-BB包涵體洗滌、溶解與復性嘗試了不同條件，大大提高了包涵體的復性效率可達40%。依據蛋白的理化特性，經過不同純化方法的結合，最終獲得具有良好生物活性和高純度的重組蛋白。本實驗建立了高表達、易純化的工藝，為大規模制備原核重組人PDGF-BB蛋白奠定了基礎。

圖7 PDGF-BB復性液SPSepharoseFF純化的SDS-PAGE M：蛋白marker；1：SP純化后的PDGF-BB重組蛋白

圖8 重組PGDF-BB的Western印跡

圖9 重組PDGF-BB對NIH3T3細胞的促增殖作用