葛胺酮-大豆卵磷脂復合物的制備、表征及體內藥代動力學研究

鄒云彭，彭濤，溫曉雪，王剛，孫云波，劉曙晨，高月，張首國，王林1,

1.北京工業大學 生命科學與生物工程學院，北京 100124；2.軍事科學院 軍事醫學研究院 輻射醫學研究所，北京 100850

葛根素（puerarin）是從葛根中提取的一種異黃酮碳苷類化合物[1]，具有顯著的抗心肌缺血[2]和抗腦缺血作用[3]。但是葛根素水溶性差、滲透性差，且易出現溶血副作用，極大地限制了其臨床應用。3′-（二甲基氨基）甲基葛根素鹽酸鹽（葛胺酮，G20）是由本課題組研發的葛根素衍生物。其抗心肌缺血和腦缺血作用強于葛根素，且無溶血副作用[4-5]。但由于G20脂溶性較差且口服生物利用度低，極大地影響了其在臨床上的優勢。

大豆卵磷脂與藥物分子的絡合技術應用廣泛，可以改善藥物口服吸收。大豆卵磷脂是一種具有兩親性的特殊載體，是哺乳動物細胞膜的主要成分之一。它不僅可以提高難溶性藥物的溶解度及藥物釋放速率，而且能增強藥物的膜滲透性[6]。意大利學者在1987年首次制備多酚類化合物的卵磷脂復合物，該復合物顯著提高了多酚類化合物的口服生物利用度[7]。迄今已有大黃酚[8]、沒食子酸[9]、黃芩苷[10]、氧化苦參堿[11]等多種中藥單體制備卵磷脂復合物，改善了活性中藥成分在生物體內的吸收。在此，我們采用L9（34）正交設計優化G20-大豆卵磷脂復合物的制備方案，對所得復合物進行X線衍射分析，評估大鼠口服G20和G20-大豆卵磷脂復合物后的生物利用度

1 材料

雄性SD大鼠，體重（250±15）g，購自軍事醫學研究院實驗動物中心；G20由本實驗室合成，HPLC檢測含量高于99%；對羥基苯甲醛、檸檬酸、大豆卵磷脂購自國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純產品；Agilent1100高效液相色譜儀為安捷倫科技（中國）有限公司產品；旋轉蒸發儀為上海亞榮生化儀器廠產品。

2 方法與結果

2.1 卵磷脂復合物的制備

取 G20（100.0mg，217.8 μmol）、大豆卵磷脂［169.9mg，217.8μmol（天然卵磷脂的平均相對分子質量為780，此時G20與大豆卵磷脂的摩爾比為1∶1）］加到2.5mL有機溶劑中，30℃攪拌2 h，濃縮得到淡黃色固體，加入氯仿溶解該固體，抽濾除去沒有反應的G20，再濃縮干燥過夜，得到G20-大豆卵磷脂復合物。

2.2 復合率的測定

G20極易溶于水，難溶于氯仿，而大豆卵磷脂和G20-大豆卵磷脂復合物都易溶于氯仿。在G20和大豆卵磷脂反應后,濃縮得到淡黃色固體,用氯仿溶解該固體中的大豆卵磷脂及所生成的卵磷脂復合物，抽濾得到沉淀，反復用氯仿洗滌沉淀，干燥后稱重，該沉淀即為不溶于氯仿的G20。按照下式計算藥物與卵磷脂的復合率：

2.3 單因素考察

2.3.1 選擇最佳反應溶劑 選取甲醇、乙醇、丙酮、四氫呋喃、氯仿、乙酸乙酯、二氧六環作為反應溶劑，其他反應條件如2.1（藥脂摩爾比為1∶1，反應溫度為30℃，反應時間為2h，反應溶劑為2.5mL）。以G20-大豆卵磷脂復合物的復合率為實驗指標，尋找最佳反應溶劑。結果顯示，上述溶劑的復合率分別為（23.03±2.56）%、（46.07±3.26）%、（26.07±1.46）%、（28.83±0.60）%、（23.73±1.27）%、（18.97±1.66）%、（34.03±2.82）%（n=3）。可以看出以乙醇為反應溶劑的復合率最高，故反應溶劑選擇乙醇。

2.3.2 選擇最佳藥脂摩爾比 研究不同藥脂摩爾比（1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶3）對 G20-大豆卵磷脂復合物復合率的影響，選定乙醇為反應溶劑，其他反應條件如2.1。復合率分別為（18.20±0.21）%、（27.57±0.10）%、（57.00±0.06）%、（54.73±0.14）%（n=3）。可以看出，隨著大豆卵磷脂比例的提高，復合率大幅度上升，但是當藥脂摩爾比為1∶2時，繼續增加大豆卵磷脂比例，復合率沒有進一步提高。大豆卵磷脂含量過高會導致復合物的黏度增大，因此選取藥脂摩爾比為1∶2。

2.3.3 選擇最佳溶劑量 研究不同溶劑體積（2.5、5、10、15、20、30、40、60mL）對G20-大豆卵磷脂復合物復合率的影響，選定乙醇為反應溶劑，其他反應條件如2.1。復合率分別為（34.27±0.24）%、（37.80±0.04）%、（55.27±0.20）%、（61.70±0.08）%、（71.70±0.12）%、（75.47±0.10）%、（80.03±0.13）%、（81.33±0.10）%（n=3）。可以看出，隨著乙醇體積的增大，復合率大幅度上升，當無水乙醇為60mL時復合率最大。

2.3.4 選擇最佳反應時間 研究不同反應時間（2、3、4、5h）對 G20-大豆卵磷脂復合物復合率的影響，選定乙醇為反應溶劑，其他反應條件如2.1。 復 合率 分 別 為（27.73±0.09）%、（28.33±0.06）%、（27.17±0.13）%、（32.17±0.12）%（n=3）。可以看出，反應時間對復合物復合率的影響較小，為了節省反應時間，選取反應時間為2h。

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2.4 正交實驗優化實驗方案

通過單因素考察可以看出，對復合率影響較大的實驗因素有藥脂摩爾比、溶劑量、反應溫度，而反應時間對復合率影響不大。采用L9（34）正交設計表，以復合率為指標，對藥脂摩爾比（A）、溶劑量（B）、反應溫度（C）進行三因素三水平正交實驗優化[12]，反應時間均為2h。采用SAS9.1統計軟件進行數據分析。實驗結果見表1，方差分析見表2。3種實驗因素對復合率的影響順序為藥脂摩爾比（A）＞溶劑量（B）＞反應溫度（C），藥脂摩爾比對復合率的影響最大。最佳實驗方案確定為A2B3C3，即G20與卵磷脂的投料摩爾比為1∶1.5，溶劑量為40mL，反應溫度為50℃。

2.5 最佳反應條件的驗證試驗

根據正交設計結果，采用最佳工藝制備G20-大豆卵磷脂復合物，測得3批樣品的復合率均為100%，說明該制備工藝穩定可靠，重現性強。

2.6 X線衍射分析（XRD）

如圖1所示，用X線衍射法評價G20在G20-大豆卵磷脂復合物中的物理狀態。G20粉末的XRD圖存在特征結晶衍射峰，而大豆卵磷脂的XRD圖呈現一個寬峰，沒有任何特征結晶衍射峰存在。G20與大豆卵磷脂的物理混合物（藥脂的摩爾比為1∶1.5）的XRD圖存在明顯的G20的特征結晶衍射峰，這說明G20以晶體形式存在于該物理混合物中。而在G20-大豆卵磷脂復合物的XRD圖中，不存在任何G20的特征結晶衍射峰，這說明G20-大豆卵磷脂復合物中沒有任何G20晶體存在。在G20-大豆卵磷脂復合物中，G20可能以分子或非晶體的形式存在，G20與卵磷脂復合物存在相互作用力，如范德華力、偶極-偶極相互作用、氫鍵[13]。

2.7 藥動學研究

2.7.1 灌胃供試液配制 取G20200.0mg,加入8mL超純水,超聲波2min，配制成含G2025 mg/mL的G20溶液。取G20-大豆卵磷脂復合物680.0mg，加入8mL0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，超聲波2min，配制成含G2025mg/mL的G20-大豆卵磷脂復合物混懸液。

表1 采用L9（34）正交設計優化G20卵磷脂復合物制備方案

表2 方差分析

圖1 大豆卵磷脂（A）、G20（B）、物理混合物（C）和G20-大豆卵磷脂復合物（D）的XRD圖

2.7.2 標準曲線繪制與方法學考察 精密吸取150μL血漿樣品于5mLEP管中，加入7.5μL適當濃度的G20溶液和7.5μL320μg/mL對羥基苯甲醛溶液（內標），簡單振搖后加入135μL 6%高氯酸水溶液沉淀蛋白，渦旋振蕩3min后超聲波5min，9500r/min離心15min，吸取全部上清液，過 0.45 μm 微孔濾膜，得到 0.1、1、4、10、40、100、140、200 μg/mL的G20血漿溶液（該溶液中內標物濃度為8μg/mL）。

HPLC采用Venusil-ASBC18色譜柱（250mm×4.6 mm，5 μm），柱溫25℃，流動相為甲醇-水（含0.2%檸檬酸，20∶80），檢測波長250nm，進樣量60 μL。以G20與對羥基苯甲醛峰面積之比為縱坐標（AG20/A內標）、G20濃度為橫坐標（C）繪制標準曲線，得回歸方程AG20/A內標=0.24C+0.014（r=0.999949）。

配制1、10、100μg/mL的質控樣品各5份，按上述血漿樣品處理方法處理，每天HPLC測定一次，連續測定3d，考察日內和日間精密度。結果表明，3種質控樣品的日內精密度RSD（n=5）分別為4.42%、2.87%、1.10%，日間精密度RSD（n=15）分別為4.07%、3.10%、2.95%，回收率（n=5）分別為（106.58±4.71）%、（99.55±2.85）%、（98.11± 1.08）%。長期凍融穩定性試驗顯示將G20血漿樣品于-20℃儲存15d，G20血漿樣品穩定性好。

2.7.3 G20與G20-大豆卵磷脂復合物的大鼠生物利用度測定 將12只SD大鼠隨機分為2組，每組6只，實驗前禁食12h，分別灌胃給予50mg/mL（按G20量計算）G20和G20-大豆卵磷脂復合物，灌胃后 5、15、30、45、60、90min和2、3、5、8、24h用肝素鈉潤洗過5mLEP管，尾靜脈取血0.6mL（約15滴）,輕輕振搖后1980r/min離心15 min得到含藥血漿[14]，-20℃凍存待用。

精密吸取150μL上述含藥血漿至5mL離心管中，加入15μL160μg/mL對羥基苯甲醛溶液，簡單振搖后加入135μL6%高氯酸水溶液沉淀蛋白，渦旋振蕩3min后超聲波5min，9500r/min離心15min，吸取全部上清液，過0.45μm微孔濾膜，得到待測樣品稀釋液（含內標物濃度為8μg/mL），取稀釋液60μL進樣分析。

藥時曲線如圖2，相應藥動學參數見表3。當SD大鼠灌胃給予G20及其卵磷脂復合物后，血藥濃度達峰時間（Tmax）從（0.555±0.473）h顯著增加到（1.250±0.250）h（P＜0.05），說明制成磷脂復合物之后，G20的作用時間延長。藥時曲線下面積（AUC）由（3.139±0.844）μg/（h·mL）增大到（5.025±0.170）μg/（h·mL）（P＜0.01）。G20-大豆卵磷脂復合物的AUC是G20的1.6倍，表明采用磷脂復合物技術可以顯著提高G20的口服生物利用度。

3 討論

正交設計是一種系統的統計方法，它能最大限度地提高測試覆蓋率并減少測試的數量[15]，適用于優化實驗方案。Liu等[16]通過L9（34）正交設計考察大豆卵磷脂的濃度、3種配料（大豆卵磷脂、膽固醇和脫氧膽酸鈉）比例對齊墩果酸脂質體包封率的影響，優化了齊墩果酸脂質體制備方案，使藥物包封率達到90%以上。本研究以G20與大豆卵磷脂的復合率為評價指標，在單因素試驗的基礎上采用正交試驗設計，使復合率達到100%。該制備工藝條件穩定，操作簡便，所得卵磷脂復合物為粉末狀，易于操作。

一些多酚類、黃酮類和萜類等植物活性成分因膜透性差、口服生物利用度低而使其應用受到限制[17]。卵磷脂與這些植物成分進行絡合，可以改善其生物利用度，通過磷脂復合物獨特的釋藥模式延長藥物作用時間[18]。在本研究中，SD大鼠分別灌胃給予G20及其卵磷脂復合物，與G20相比，其卵磷脂復合物的口服生物利用度提高了160%。本研究結果可為進一步研發G20口服制劑提供參考。

圖2 G20和G20-大豆卵磷脂復合物的藥時曲線

表3 G20和G20-大豆卵磷脂復合物的藥動學參數（x±s，n=6）

參考文獻