齲病感染牙髓相關基因的篩選與生物信息學分析

董寧，丁良，戴姍姍，郭青玉

陜西省顱頜面精準醫學研究重點實驗室，陜西省牙頜面疾病臨床研究中心，西安交通大學 口腔醫學院兒童口腔科，陜西 西安 710004

牙髓受到齲病等各種刺激會觸發自身的防御和修復功能而呈現應答反應，隨后通過各種細胞因子介導的一系列復雜的細胞、蛋白、細胞因子的級聯反應，最終實現修復損傷、重建組織，其具體機制尚不清楚且難以進行外源性操控[1]。基因組篩選和芯片等高通量技術的不斷發展豐富，為我們提供了一個獲取齲病分子水平信息的研究利器。我們綜合利用生物信息學工具，對正常和齲壞牙髓的相關基因表達譜數據進行分析，并對齲病相關差異表達基因進行初步篩選，為下一步研究提供線索。

1 材料和方法

1.1 材料

研究數據取自齲壞牙髓相關基因表達芯片（GSE1629），下載自美國國立生物技術信息中心（NCBI）基因表達數據庫（Gene Expression Omni?bus，GEO），由 McLachlan等提交，實驗平臺是 Af?fymetrix公司的HG-U133A芯片。共4組樣本，齲壞 牙 髓（GSM27725、GSM27726）和 正 常 牙 髓（GSM27727、GSM2778）各2組。樣本取自12顆臨床診斷健康及11顆臨床診斷為深齲（牙本質深層未穿髓、無炎癥）的因正畸原因拔除的前磨牙或磨牙，患者年齡 20～30 歲[2]。

1.2 差異基因分析及篩選

用在線分析工具MORPHEUS（https://software.broadinstitute.org/morpheus/）進行統計學分析。樣本按齲壞和正常分為2組，進行比較，以P＜0.05、差異表達倍數（foldchange）≥2作為差異基因的篩選條件。

1.3 差異基因的基因本體論（geneontology，GO）富集分析和通路分析

將篩選出的上調及下調差異基因列表導入DAVID數據庫（https://david.ncifcrf.gov/），利用生物學注釋進行相關的GO富集分析（生物學過程、分子功能、細胞組成）和KEGG通路分析[3-4]。設定P＜0.05、FDR＜0.05，進行篩選匹配。

1.4 差異基因編碼蛋白的相互作用網絡和節點分析

將差異基因導入STRINGv10.0（http://string.Db.org/）[5]，分析其所編碼的蛋白之間的相互作用，找出關鍵節點的蛋白質，綜合分數（combined score）＞0.4定為有效篩選標準。隨后用Cytoscape軟件構建蛋白質相互作用（protein-proteininterac?tion，PPI）網絡，用其 MCODE（MolecularComplex Detection）插件深入篩檢其中關聯性強的蛋白互作模塊，標準為分數大于4，節點數和互作數不少于10個。

2 結果

2.1 差異基因

共篩選出齲壞牙髓差異表達基因375個，其中表達上調253個，表達下調122個（圖1A）。

2.2 差異基因的GO富集分析

結果見表1（按P值高低排名，部分展示）。篩選出的上調基因主要富集在生物學過程（bio?logicalprocess，BP）201個分類（免疫應答、炎癥反應、細胞因子應答和細胞活化調控等）、分子功能（molecularfunction，MF）14個分類（抗原結合、受體結合、細胞因子活性和分子傳感活性等）、細胞組分（cellcomponent，CC）26個分類（胞外間隙、主要組織相容性復合體、膜結合囊泡和溶酶體等）；下調基因主要富集于6個BP分類（生物礦化組織發育、細胞突起形態發生、細胞組分形態發生、細胞突起組建、細胞黏附和生物附著）和2個CC分類（蛋白質細胞外基質和細胞外基質）。

2.3 KEGG通路分析

按設定條件篩選后，上調差異基因所涉及的KEGG通路分析有17條被保留，包括金黃色葡萄球菌感染、吞噬體、抗原加工提呈及NF-κB信號通路等（表2，部分展示）。下調基因未有有效涉及通路獲得保留。

圖1 差異表達基因分析

2.4 差異基因編碼蛋白相互作用網絡

STRING檢測結果顯示，上調基因PPI網絡共涵蓋195個節點蛋白和411個蛋白互作（圖1B），下調基因PPI網絡共涵蓋105個節點蛋白和62個蛋白互作（圖 1C）。其中 MMP9、CXCL12、IL-8、PTPRC、LYN、CXCR4、CD44、CXCL1、SERPINA1、CTSS蛋白的互作多于10條，被認為是中心節點基因且均為上調基因（表3）。MCODE分析得到2個高顯著性蛋白互作模塊，均處于上調差異基因互作網絡中（圖1D）。

3 討論

牙髓牙本質復合體的內生性修復再生是機體防御齲病的重要手段，其機制亦是近年來的研究熱點，其中涉及的分子和細胞相互作用非常復雜，若能控制炎癥損傷與再生之間的平衡，將促進牙髓組織愈合[6]。本研究綜合應用生物信息學工具，篩選得到牙髓組織中與齲病發生相關的差異基因，并通過構建PPI網絡深入發掘出齲病相關性高的核心基因，富集分析結果顯示這些基因可能加強了病理狀態下組織的免疫應答和抗原抗體反應，同時活化了炎癥相關細胞因子并調控機體的應激反應。同時由于組織受到破壞，部分生物礦化因子及細胞形態發生相關基因的表達亦受到抑制。

表1 齲齒牙髓GO富集分析結果

表2 齲壞牙髓中上調差異基因涉及的KEGG通路分析結果

表3 差異基因的蛋白質相互作用網絡中心節點基因

其中多數表達上調的細胞因子/趨化因子相關基因處于網絡中心位置，說明在齲壞牙髓防御中占有重要地位。在篩選得到的中心蛋白中，基質 金 屬蛋 白 酶 9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）是基質金屬蛋白酶家族（MMPs）中的一員，亦是基質重建的調控因子之一，參與了細胞外基質局部的蛋白水解和白細胞遷移，同時與破骨細胞吸收有關[7]。MMPs家族是已知重要的生物活性劑和生長因子，被證實參與了病理過程中細胞外基質的崩解，并在修復性牙本質形成過程中有調節牙本質分解產物的潛能[8]。CD44是透明質酸受體，介導細胞間和細胞與基質間的相互作用，同時與MMPs家族蛋白、骨橋蛋白和膠原蛋白的關系密切，在細胞遷移、淋巴細胞募集歸巢和血細胞生成等活動中起重要作用[9]。CTSS（ca?thepsinS）是一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶，在2型組織相容復合體分子（MHCⅡ）的遞呈中，將抗原蛋白降解成多肽[10]。而牙髓樹突狀細胞可表達MHCⅡ分子，當牙本質遭到齲壞侵襲時，未成熟的抗原提呈樹突狀細胞會通過遷移來捕獲外來抗原[11]。

IL-8（interleukin8，白細胞介素 8；或 C-X-C motifchemokineligand8，C-X-C基序趨化因子配體 8）、CXCL12、CXCL1、CXCR4（C-X-Cmotifche?mokinereceptor，C-X-C基序趨化因子受體4）同屬趨化因子家族，廣泛存在于血管、肝臟、神經系統、肌肉等多種組織和細胞中。不但參與正常組織的形成，也介導炎癥的發生發展和損傷修復反應[12]。IL-8已成為衡量牙髓炎癥的一個重要指標，研究證實人牙髓細胞（humandentalpulp cells，hDPCs）在炎癥條件下會高表達 IL-8，牙髓干細胞受到脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激后會產生IL-8等大量促炎因子[13]。而趨化因子在清除感染的同時，也與生長因子協同作用促進組織的修復過程。MTA（mineraltrioxideaggre?gate，無機三氧化聚合物）蓋髓實驗發現，組織修復過程中細胞釋放的IL-1α、-1β、-2、-6、-8明顯增加[14]。CXCR4是目前所知的基質細胞衍生因子1（stromalcell-derivedfactor-1，SDF-1）的惟一受體，二者構成SDF-1/CXCR4軸，其介導成體干細胞定向遷移歸巢和在血管新生和組織再生修復中的作用已受到廣泛關注，并擴展到牙髓再生治療的研究中[15]。而在大鼠牙本質-牙髓損傷修復模型中觀察發現SDF-1α、CXCR4的表達呈現時間和程度相關性，提示二者可能參與誘導了修復性牙本質的形成[16]。

本實驗分析結果的多樣性也反映了齲病發生發展的復雜性，覆蓋了多種生理病理反應，其牽涉基因、蛋白種類之多，也印證了齲病控制之困難。其在齲病病因和牙髓修復再生研究中的預測價值，除炎癥因子等少部分基因已在歷年研究中獲得證實或得到部分驗證，多數差異基因還須通過大量臨床病例驗證和體內外實驗研究證實。此外，鑒于齲病的多樣性和研究工具的不斷發展，將來仍然需要涉及不同地區、人群，不同研究平臺的大量的樣本來不斷充實和驗證我們的結果。