麻醉期間低體溫對發(fā)育期大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬凋亡率的影響

劉文博 熊興龍 楊劍 禹文峰 歐煒 呂潔

貴州醫(yī)科大學(xué)1麻醉學(xué)院，2分子生物學(xué)教研室（貴陽 550004）

全身麻醉由于各種因素對體溫調(diào)節(jié)系統(tǒng)影響，導(dǎo)致患者外周血管擴張和中心體溫下降發(fā)生低體溫，是圍術(shù)期最常見的并發(fā)癥之一。有文獻報道，50%～70%的手術(shù)患者出現(xiàn)低體溫，在實施外科手術(shù)的患者中，小兒更易發(fā)生低體溫。圍術(shù)期意外的低體溫將給機體帶來不良后果，尤其是對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不利影響不能忽視：長時間的冷暴露可以引起大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷［1］，并可能導(dǎo)致海馬區(qū)域的功能損害［2］。機體受到寒冷損傷時可由氧化損傷導(dǎo)致其進一步發(fā)展：誘導(dǎo)腦水腫，繼發(fā)損傷及細(xì)胞凋亡［3］；國外曾有文獻報道低溫可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［4］，國內(nèi)也有中低溫體外循環(huán)可誘導(dǎo)大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的報道。然而目前國內(nèi)外并無低體溫是否造成發(fā)育高峰期海馬凋亡并引起遠期記憶障礙的相關(guān)研究，因此本研究選取7 d齡新生大鼠，建立全麻誘導(dǎo)的低體溫模型，通過動物行為學(xué)測試并檢測海馬組織凋亡率，擬探討麻醉期間低體溫狀態(tài)對發(fā)育期大鼠遠期學(xué)習(xí)記憶能力及海馬組織凋亡率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 7日齡SD新生大鼠（貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供）；丙泊酚（批號：16KK5643，北京費森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司）；DMEM（HyClone公司）；胎牛血清（BI公司）；AnexinFITC/PI雙染試劑盒（BD公司）；流式細(xì)胞儀（BECTON DICKLNSON公司）；

1.2 方法

1.2.1 動物及分組 出生7 d的SD新生大鼠40只，12～16 g，雌雄各半，按隨機數(shù)字表法分為四組（n=10）：對照組（C組）、麻醉保溫組（A組）、麻醉低溫組（AH組）、物理低溫組（H組）。C組腹腔注射0.1 mL生理鹽水并配備加熱墊保持直腸溫度在38～39℃；A組以25 mg/kg腹腔注射異丙酚0.1 mL，每20 min追加初始劑量的一半，麻醉2 h，同方法保持直腸溫度在38～39℃；AH組麻醉方式及時間與A組相同，大鼠在麻醉過程中不保溫，控制室溫條件為23℃，允許體溫自然地下降；H組大鼠腹腔注射0.1 mL生理鹽水，物理降溫方式與AH組相同。麻醉過程中持續(xù)吸氧，觀察大鼠呼吸、皮膚顏色，大鼠腹部固定帶狀嬰兒脈搏血氧飽和度探頭，持續(xù)監(jiān)測SpO2（并維持SpO2在95%～99%），從麻醉開始即刻至麻醉結(jié)束時，每20 min記錄一次，標(biāo)記時間點為T0～T6，防止大鼠腦缺氧。間斷監(jiān)測大鼠體溫變化，每20 min記錄1次，標(biāo)記時間點為T0～T6。

1.2.2 行為學(xué)測試 每組隨機選取5只大鼠飼養(yǎng)至30 d采用Morris水迷宮檢測實驗動物的空間學(xué)習(xí)記憶能力。Morris水迷宮測試程序主要包括定位航行實驗和空間探索實驗兩個部分，歷時6 d。根據(jù)池壁上標(biāo)記的四個入水點，將水池分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個象限，第Ⅳ象限處存在隱匿平臺。行定位航行實驗時，大鼠每天分別從各象限入水點處入水，由圖像采集及處理系統(tǒng)記錄小鼠航行軌跡，令實驗動物在水迷宮內(nèi)自由游泳2 min尋找隱匿平臺（1.5 cm），并記錄找到平臺所需時間（逃避潛伏期），若120 s內(nèi)未找到平臺記錄為120 s，實驗連續(xù)進行5 d，每天訓(xùn)練4次。第6天行空間探索實驗，拆掉水下平臺，同樣令動物自由游泳2 min，記錄2 min內(nèi)穿越平臺次數(shù)及原平臺象限逗留時間。測試過程中保持實驗室內(nèi)燈光、物品等空間參照物擺放位置不變，水溫保持在（25.0±1.0）℃，以排除干擾因素。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測海馬組織凋亡率 分別于大鼠麻醉清醒后即刻和Morris水迷宮測試結(jié)束時，每組隨機選取5只大鼠處死，于冰上斷頭取大腦海馬組織。置于冰凍PBS中，剪碎，清洗3次。將處理后的組織移入15 mL離心管中，加入0.25%胰酶1 mL，置于37℃恒溫水浴箱中消化30 min。加入DMEM（含10%胎牛血清）1 mL終止消化。經(jīng)300目濾網(wǎng)過濾后，轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，1 000 r/min，離心5 min，棄上清加入PBS 2 mL搖勻，再次同樣轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清加入PBS 1 mL搖勻。將制備好的單細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為1×106個/mL，取1 mL細(xì)胞，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，加入400 mL 1×Binding Buffer液中，加入5 mL Annexin V?FITC 和 5 mL Propidium Iodide，混勻，避光孵育15 min。1 h內(nèi)上機檢測，所用試劑盒為Anexin?FITC/PI雙染試劑盒，流式細(xì)胞儀為美國BECTON DICKLNSON公司生產(chǎn)。所得數(shù)據(jù)采用Flowjo 10進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，不同時點比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較 四組大鼠SpO2均在正常范圍，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。麻醉期間，分別與C、A組比較，AH、H組大鼠體溫明顯下降（P＜0.05）（圖1）。

表1 4組大鼠SpO2比較Tab.1 Comparison of SpO2in 4 groups（n=10）±s，%

表1 4組大鼠SpO2比較Tab.1 Comparison of SpO2in 4 groups（n=10）±s，%

組別C組A組AH組H組T0 96.2±1.4 95.8±2.5 96.4±2.7 96.0±2.1 T1 96.2±1.3 94.2±1.9 95.0±1.8 96.2±1.6 T2 97.2±1.3 96.4±0.8 96.6±1.8 96.6±2.0 T3 95.8±1.0 96.2±1.3 95.8±1.0 96.0±2.4 T4 97.0±2.1 96.0±1.5 95.8±2.2 97.4±1.8 T5 97.0±0.7 96.0±1.2 95.4±1.5 97.0±2.0 T6 97.2±1.0 96.8±1.3 97.6±1.1 96.8±0.8

圖1 四組大鼠體溫比較Fig.1 Comparison of temperature in 4 groups

2.2 動物行為學(xué)測試比較 各組間逃避潛伏期差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表2）；空間探索試驗中，四組大鼠穿越平臺次數(shù)及原平臺象限逗留時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表3）。

2.3 海馬組織凋亡率比較 由散點圖可見，凋亡率為Q2象限和Q3象限細(xì)胞數(shù)總和所占百分比。在7日齡大鼠中，分別與C、A組比較，AH、H組凋亡率增高（P＜ 0.05）（圖2）。在36日齡大鼠中，四組凋亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3）。

表2 4組大鼠逃避潛伏期的比較Tab.2 Comparison of escape latency in 4 groups（n=5）±s，s

表2 4組大鼠逃避潛伏期的比較Tab.2 Comparison of escape latency in 4 groups（n=5）±s，s

分組C組A組AH組H組第1天72.3±23.1 93.7±22.2 83.8±19.7 70.8±22.1第2天46.8±23.2 49.0±21.4 44.5±18.8 43.1±24.3第3天44.6±21.6 46.4±23.3 41.2±21.8 48.0±19.6第4天23.6±13.3 22.5±10.1 26.0±10.2 22.0±7.8第5天17.4±13.5 18.8±5.8 21.0±11.2 22.9±3.5

表3 4組大鼠穿越平臺次數(shù)及原平臺象限逗留時間比較Tab.3 Comparison of the times of crossing the platform and the time of staying original platform quadrant in 4 groups（n=5）±s

表3 4組大鼠穿越平臺次數(shù)及原平臺象限逗留時間比較Tab.3 Comparison of the times of crossing the platform and the time of staying original platform quadrant in 4 groups（n=5）±s

組別C組A組AH組H組穿越平臺次數(shù)7.6±3.9 7.2±4.4 8.6±3.3 6.4±4.2原平臺象限逗留時間（s）55.4±21.5 44.4±13.3 42.6±6.6 40.7±14.3

圖2 7日齡四組大鼠凋亡率比較Fig.2 Comparison of apoptotic rate of 7?day?old rats in four groups

3 討論

圖3 36日齡四組大鼠凋亡率比較Fig.3 Comparison of apoptotic rate of 36?day?old rats in four groups

海馬體（hippocampus）位于大腦丘腦和內(nèi)側(cè)顳葉之間，屬于邊緣系統(tǒng)的一部分，其功能與學(xué)習(xí)記憶、情緒反應(yīng)等密切相關(guān)。海馬受損會導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙。流式細(xì)胞術(shù)工作原理是在細(xì)胞分子水平上通過單克隆抗體對單個細(xì)胞或其他生物粒子進行多參數(shù)、快速的定量分析，是當(dāng)代最先進的細(xì)胞定量分析技術(shù)之一。細(xì)胞凋亡早期位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷酯酰絲氨酸（PS）遷移到膜外，可利用AnnexinV對PS的高度親和力將凋亡細(xì)胞標(biāo)記出來。但壞死細(xì)胞由于PS暴露于細(xì)胞外也呈An?nexinV陽性，因此需要采用PI這一參數(shù)將壞死細(xì)胞區(qū)分開來。壞死細(xì)胞PI強染色，而凋亡細(xì)胞染色較弱。AnnexinV/PI雙參數(shù)法能夠檢測早期細(xì)胞凋亡，可以正確區(qū)分凋亡和壞死，多數(shù)文獻推薦其作為流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡的方法［5］。因此本研究采用AnnexinV/PI雙參數(shù)法檢測低溫對海馬組織凋亡率的影響。

根據(jù)現(xiàn)有文獻［6］并結(jié)合初步實驗結(jié)果，當(dāng)丙泊酚劑量為25 mg/kg時，即可達到麻醉效果，使新生大鼠翻正反射消失，所以筆者選擇該劑量進行麻醉，持續(xù)時間為2 h。大鼠是晚成性哺乳動物，新生大鼠體溫調(diào)節(jié)能力微弱，將幼體單獨隔離后其體溫會因環(huán)境溫度的變化而變化，直至達到接近環(huán)境溫度的水平［7］。因此筆者通過調(diào)控實驗室環(huán)境溫度為23℃，在不保溫的條件下，使新生大鼠體溫隨環(huán)境溫度而下降，結(jié)合預(yù)實驗并參照WHITTINGTON等［8］的研究，將體溫最低降至25℃左右。

由研究結(jié)果可以看出：7 d齡大鼠中，處于低體溫狀態(tài)的兩組海馬組織凋亡率均明顯增高。而通過對體溫相近的兩組間比較，發(fā)現(xiàn)海馬組織凋亡率含量無明顯差異，提示低體溫可能是造成凋亡率增高的主要原因。其機制可能與多種因素有關(guān)，已有文獻報道在寒冷應(yīng)激狀態(tài)下Akt（蛋白激酶B）?ERK信號通路表達下調(diào)［9］，Akt及ERK與細(xì)胞的凋亡有著密切的關(guān)系，其下調(diào)可能是參與導(dǎo)致凋亡率增高的原因之一［10］。在低體溫條件下，由于大鼠海馬ATP含量下降，受其調(diào)控的cAMP/PKA通路表達的下調(diào)同樣可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。低溫可降低神經(jīng)細(xì)胞間廣泛存在的縫隙連接通訊功能，影響了營養(yǎng)物質(zhì)在細(xì)胞間的傳遞，因此，同樣也可造成神經(jīng)組織的損害［11］。低溫也可誘導(dǎo)海馬組織中Tau蛋白過度磷酸化，產(chǎn)生細(xì)胞毒性并介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡［12］。另有研究表明麻醉期間低體溫可引起大鼠神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，降低腦內(nèi)胰島素對凋亡的抑制作用［13-14］。低體溫狀態(tài)下凋亡率增高可能還與冷環(huán)境刺激引起細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白相關(guān)基因表達高于Bcl?2相關(guān)基因表達有關(guān)［15］。

為了測試低體溫是否對各組間的遠期學(xué)習(xí)記憶能力同樣造成影響，我們采用Morris水迷宮測試大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，并同樣檢測海馬組織凋亡率。結(jié)果表明在36日齡大鼠水迷宮測試結(jié)束時，各組行為學(xué)測試結(jié)果及海馬組織凋亡率均無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能是由于短時間內(nèi)低體溫對神經(jīng)系統(tǒng)的損害是可逆的，其造成的影響會隨體溫的恢復(fù)而逐漸消失，國外亦有與本研究結(jié)果一致的報道［16］。

綜上所述，在本研究低體溫范圍內(nèi)，麻醉期間體溫降至25℃時可短期誘導(dǎo)新生大鼠海馬組織凋亡率增高，而對其遠期學(xué)習(xí)記憶能力無明顯影響。本研究為嬰幼兒臨床麻醉中需要注意加強保溫措施，以預(yù)防低體溫造成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害，提供了一定的實驗參考數(shù)據(jù)。但本實驗未進一步研究其分子機制且樣本量較少，以及由于本實驗中低溫處理的時間略短而未能體現(xiàn)低體溫造成的遠期危害，這些都是本研究的不足之處。為進一步完善本研究，后續(xù)筆者將針對麻醉期間低體溫大鼠進行凋亡相關(guān)蛋白等機制的探討。

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