HBx上調(diào)TGF?β/TβR?Ⅱ通路對肝細(xì)胞癌索拉菲尼耐藥的影響

邢健鸚 何遠(yuǎn)學(xué) 曾洪蘭 陳家誠 周鈺 沈群 周文珂 陳曉玲葉文玉 武金才

海南省人民醫(yī)院1預(yù)約診療服務(wù)中心，2傳染科，3肝膽外科，4門診部，5膽胰外科（海口570311）

在我國，肝細(xì)胞癌是極為常見的一種惡性腫瘤，具有早期診斷率低、進(jìn)展快與病死率高等特點(diǎn)［1］。特別是多數(shù)患者在就診時(shí)已為晚期，失去了手術(shù)治療機(jī)會(huì)，大多進(jìn)行化療。但因?yàn)楦渭?xì)胞癌在早期的診斷率不高，確診時(shí)常常已經(jīng)進(jìn)入晚期，已然失去根治機(jī)會(huì)［2-3］。在治療肝細(xì)胞癌時(shí)，化療能夠?qū)χ委熎鸬胶芎玫妮o助效果，可是對于化療藥物，肝癌細(xì)胞的敏感性較差，極易形成耐藥性。在臨床治療上，索拉菲尼是一種多激酶抑制劑，能夠起到抑制抗血管生成以及腫瘤細(xì)胞增殖等作用，在肝細(xì)胞癌中的應(yīng)用多見［4］。但是由于先天或獲得的耐藥性導(dǎo)致索拉菲尼延長肝細(xì)胞癌的中位生存期有限，為此需要積極研究肝細(xì)胞癌索拉菲尼耐藥的影響機(jī)制［5-6］。HBX基因是HBV重要的功能基因，也是乙型病毒性肝炎基因組中的一個(gè)多功能反式激活因子，在肝癌細(xì)胞中的整合率超過70.0%，是肝癌產(chǎn)生耐藥性的重要原因之一［7］。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，HBX基因在整合時(shí)能夠利用ERK1/2信號(hào)通路在HIF?1α介導(dǎo)下促進(jìn)多藥耐藥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而使肝癌細(xì)胞獲得多藥耐藥的表型［8-9］。在肝癌細(xì)胞細(xì)胞通路傳遞中，TGF?β通過受體復(fù)合物傳遞信號(hào)，輔助受體能促進(jìn)相關(guān)受體復(fù)合物的形成，并決定TβR?Ⅱ的特異性，TβR?Ⅱ可通過磷酸化Ⅰ型受體的GS區(qū)而激活Ⅰ型受體的激酶活性，然后在肝臟慢性炎癥促進(jìn)肝癌發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用［10-12］。本課題應(yīng)用多種方法來探究HBx上調(diào)TGF?β/TβR?Ⅱ通路對肝細(xì)胞癌索拉菲尼耐藥的影響，具體分析肝癌細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性的分子機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBX蛋白的HepG2?HBx細(xì)胞與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒的HepG2?3.1細(xì)胞均在本實(shí)驗(yàn)室長期保存及培養(yǎng)，所有細(xì)胞均用10%滅活胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基，在溫度為37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。DMEM（Gibco公司）、胎牛血清（FBS，Gibco，USA）、胰蛋白酶（Gibco公司），MTT（Sigma公司），索拉菲尼（Sigma公司），TGF?β、HBx抗體（Cell Signaling Technology，CST）；免疫熒光試劑（Santa Cruz公司）。

1.2 細(xì)胞處理 HepG2?HBx細(xì)胞與HepG2?3.1細(xì)胞培養(yǎng)于含1 mg/mL G418的完全培養(yǎng)基中，以維持其抗性表型，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。以含梯度濃度的索拉菲尼的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)細(xì)胞/孔，培養(yǎng)24 h后接種于96孔中，以含梯度濃度的索拉菲尼的培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，孵育4 h后終止培養(yǎng)。每孔加入酸化的DMSO 100 μL，于酶標(biāo)儀檢測波長為570 nm時(shí)的吸光度A值，繪制細(xì)胞生長曲線。肝癌細(xì)胞抑制率（%）=［（A對照組-A實(shí)驗(yàn)組）/A對照組］×100%，重復(fù)3次，然后計(jì)算索拉菲尼的IC50值。

1.3 流式凋亡檢測 HepG2?HBx細(xì)胞與HepG2?3.1細(xì)胞分別接種于24孔板中后，至80%密度時(shí)，分別換用含50 μg/mL的索拉菲尼的完全培養(yǎng)，作用24 h后消化收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，用annexinV?FITC 結(jié)合緩沖液（5 μL annexin V?FITC stock與10 μL PI）重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度約5×105/mL左右。室溫下進(jìn)行10 min孵育，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，通過運(yùn)用軟件CellQuest來分析細(xì)胞凋亡情況。

1.4 免疫印跡分析 消化收集HepG2?HBx細(xì)胞與HepG2?3.1細(xì)胞，用IP裂解液裂解細(xì)胞，冰上放置 30 min，12 000 r/min離心10 min，收集上清，裝成小份凍存于-80℃，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用GE公司提供的軟件ImageQuant進(jìn)行灰度掃描和分析，并得出蛋白的相對表達(dá)量，以β?actin作為內(nèi)標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 在此次實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用軟件SPSS 20.00展開分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差與百分比來描述計(jì)量資料與計(jì)數(shù)資料，計(jì)量數(shù)據(jù)與計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的對比為t檢驗(yàn)與卡方分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥性對比分析 應(yīng)用免疫印跡技術(shù)鑒定HepG2?HBx細(xì)胞與HepG2?3.1細(xì)胞的HBX蛋白表達(dá)情況，可見HepG2?HBx細(xì)胞的HBX蛋白表達(dá)明顯高于普通的HepG2?3.1細(xì)胞（P＜ 0.05）。見圖1。為研究HBX是否會(huì)引起肝癌細(xì)胞耐藥性增加，以索拉菲尼處理HepG2?HBx細(xì)胞與HepG2?3.1細(xì)胞72 h后再行MTT檢測，結(jié)果顯示索拉菲尼對HepG2?HBx細(xì)胞的 IC50值為 HepG2?3.1 細(xì)胞的4.65倍。

圖1 HepG2?HBx細(xì)胞與HepG2?3.1細(xì)胞的HBX蛋白表達(dá)Fig.1 The expression of HBX protein in HepG2?HBx cells and HepG2?3.1 cells

2.2 細(xì)胞凋亡對比 采用annexinV/PI法比較了HepG2?HBx細(xì)胞與HepG2?3.1細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果顯示索拉菲尼作用24 h后，HepG2?HBx細(xì)胞的凋亡率要明顯低于HepG2?3.1細(xì)胞的凋亡率（P＜0.05）。見表1。

2.3 耐藥相關(guān)蛋白檢測分析 經(jīng)培養(yǎng)24、48、72 h后的HepG2?HBx細(xì)胞與HepG2?3.1細(xì)胞進(jìn)行收集，提取蛋白進(jìn)行免疫印跡法檢測TGF?β蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示HepG2?HBx細(xì)胞較HepG2?3.1細(xì)胞的多藥耐藥蛋白TGF?β表達(dá)量明顯增高（P＜0.05）。見圖2。

表1 經(jīng)過索拉菲尼處理的不同細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率對比Tab.1 The rate of cell apoptosis in different cells treated by sorafenib ± s，%

表1 經(jīng)過索拉菲尼處理的不同細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率對比Tab.1 The rate of cell apoptosis in different cells treated by sorafenib ± s，%

細(xì)胞HepG2?HBx細(xì)胞HepG2?3.1細(xì)胞t值P值n33細(xì)胞凋亡率13.56±2.19 4.89±1.63 8.392＜0.05

圖2 耐藥相關(guān)蛋白檢測對比Fig.2 Detection and comparison of drug resistance related proteins

3 討論

乙肝是當(dāng)今主要的傳染病之一，目前全球乙肝患者超過4億人，其中部分患者可發(fā)展為肝細(xì)胞癌。雖然化療為肝癌的主要治療方法，但是臨床發(fā)現(xiàn)肝癌對化療并不敏感，而肝癌組織常表達(dá)多藥耐藥基因，這可能與肝癌對化療的低應(yīng)答有關(guān)［13-14］。

HBX感染跟肝細(xì)胞癌的形成及發(fā)展存在密切關(guān)系，在HBV基因組當(dāng)中，HBX基因是功能基因，能夠發(fā)揮重要作用，能直接或間接地在乙肝進(jìn)展為肝癌時(shí)發(fā)揮重要影響［15］。在HBV病毒基因組當(dāng)中，HBV的X基因是最小的開放性讀碼框，全長435～462 bp，編碼長度為154個(gè)氨基酸的蛋白（HBx）。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，HBx蛋白在NF?κB、TGF?β通路等多條細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中都有參與，HBx蛋白的過度表達(dá)能夠?qū)?xì)胞轉(zhuǎn)化起到誘導(dǎo)作用，而且HBx蛋白可以跟抑癌基因p53產(chǎn)生相互作用，讓其失去原有功能［16-17］。索拉菲尼是目前唯一對肝癌有效的分子靶向藥物，臨床上也將索拉菲尼作為晚期肝癌的首選也是唯一治療藥物，但是耐藥性也比較明顯。本研究顯示索拉菲尼對HepG2?HBx細(xì)胞的 IC50值為HepG2?3.1細(xì)胞的4.65倍，表明HBX上調(diào)可導(dǎo)致肝癌細(xì)胞對索拉菲尼藥物產(chǎn)生更好的耐藥性，說明在肝癌細(xì)胞形成耐藥性時(shí)HBX蛋白起到重要作用［18］。經(jīng)過HIF?1α的介導(dǎo)，HBX基因能夠?qū)Χ嗨幠退幱嘘P(guān)基因轉(zhuǎn)錄起到促進(jìn)作用，使得化療藥物的非選擇性外排增加，肝癌細(xì)胞得到多藥耐藥表型［19］。HBx蛋白也參與了肝癌細(xì)胞的耐藥及免疫逃避，也能調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬作用。有研究表明HBX基因整合于宿主HepG2細(xì)胞基因組后，加快了有害大分子物質(zhì)的循環(huán)，也可能通過改變了宿主細(xì)胞的自噬水平，對暴露于化療藥物下的癌細(xì)胞起到了保護(hù)作用，使得肝癌細(xì)胞的耐藥性增強(qiáng)［20］。

現(xiàn)階段，在治療晚期肝細(xì)胞癌時(shí)主要采用的手段有生物治療、化療等，主要是誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，從而起到抗腫瘤效果［21］。化療藥物能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，敏感性主要是依賴前凋亡與抗凋亡信號(hào)的平衡。如今，在治療肝癌時(shí)碰到的難題就是耐藥性，在我國，乙肝的發(fā)病率相對較高，經(jīng)過研究證明形成肝癌的一個(gè)主要誘因就是HBV［22］。本研究結(jié)果顯示索拉菲尼作用24 h后，HepG2?HBx細(xì)胞的凋亡率要明顯低于HepG2?3.1細(xì)胞的凋亡率（P＜0.05），表明HBX的表達(dá)上調(diào)能抑制肝癌細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮耐藥作用。

若發(fā)現(xiàn)耐藥過程當(dāng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的信號(hào)通路與分子，且正好是對應(yīng)靶向藥物，那么就可以降低肝癌細(xì)胞的耐藥性。HBX蛋白的穩(wěn)定表達(dá)對HepG2細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生了影響，HBX蛋白參與并提升了化療藥物外排，使得細(xì)胞系增強(qiáng)了耐藥性［23］。基礎(chǔ)研究顯示VEGFA的擴(kuò)增預(yù)示著對索拉菲尼的敏感性增加，Atf2信號(hào)通路也影響索拉菲尼藥物敏感性。TβR?Ⅱ/TGF?β通路在調(diào)控肝臟炎癥促進(jìn)肝癌發(fā)生過程中起到重要作用，在人類肝癌當(dāng)中，TGF?β信號(hào)通路普遍失活，而且TβR?Ⅱ受體基因表達(dá)明顯降低，抑制性Smad7表達(dá)升高［23］。基礎(chǔ)研究表明外源性TGF?β能夠?qū)Π暾鸗GF?β信號(hào)通路的細(xì)胞增殖進(jìn)行抑制，TβR?Ⅱ表達(dá)沉默后，細(xì)胞生長遲緩、凋亡顯著增加［24-25］。植入TβR?Ⅱ基因沉默的肝癌細(xì)胞后，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝癌生長受到抑制［26］。本研究免疫印跡檢測顯示HepG2?HBx細(xì)胞較HepG2?3.1細(xì)胞的多藥耐藥蛋白TGF?β表達(dá)量明顯增高（P＜0.05）。也表明HBX誘導(dǎo)和上調(diào)了TβR?Ⅱ的表達(dá)，肝癌細(xì)胞主動(dòng)性降低胞內(nèi)化療藥物濃度的作用增強(qiáng)，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。也有研究表明TβR?Ⅱ在肝癌中滅活有利于腫瘤細(xì)胞逃避其抑制細(xì)胞增殖的作用，影響肝癌惡性程度、侵襲能力等生物學(xué)特性［27-28］。

總之，HBx可通過上調(diào)TGF?β/TβR?Ⅱ通路的表達(dá)，從而提高索拉菲尼對肝癌細(xì)胞的耐藥性，降低細(xì)胞凋亡率，HBx是引起肝癌細(xì)胞耐藥的重要因素之一。

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