大黃黃芩配伍對內毒素血癥模型大鼠血清中炎癥因子的影響研究

向麗，王沛明，胡櫻凡，王平，孟憲麗

內毒素血癥是由細菌內毒素（LPS）進入血液后引發的一系列生理病理改變，嚴重時甚至危及生命。研究表明LPS進入機體后，經過一系列的炎癥反應最終導致炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6及NO的大量釋放，這些炎癥因子的大量釋放又會進一步加重炎癥反應，造成機體的炎性損傷[1]。

大黃-黃芩作為方劑中的經典藥對，兩者合用瀉火解毒，多用于熱毒證的治療。現代研究表明大黃、黃芩單味藥對炎癥和內毒素血癥有良好的緩解和改善作用[2]，然而有關二者配伍使用的相關研究卻報道較少。本研究擬通過建立內毒素血癥大鼠模型，觀察大黃黃芩配伍后對LPS誘導的血清中TNF-α、IL-1β、IL-6及NO影響，初步探討大黃-黃芩配伍后對內毒素血癥大鼠的保護作用及作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠50只，體重200～240 g。由四川成都達碩科技有限公司所提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（川）2013-24。飼養于成都中醫藥大學中醫臟腑病癥實驗室動物房（22±3℃，40% ～70%），SPF級，動物使用許可證號：SCXK（川）2012-179。

1.2 藥物與試劑

大黃與黃芩藥材購自北京本草方源藥業有限公司，經成都中醫藥大學藥學院嚴鑄云教授鑒定分別為藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根和唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi.的干燥根。LPS（美國Sigma公司，Ecoli O55:B5）； TNF-α ELISA 試劑盒（上海依科賽科技股份有限公司，批號141202）；IL-1β ELISA 試劑盒（上海依科賽科技股份有限公司，批號：141202）；IL-6 ELISA試劑盒（上海依科賽科技股份有限公司，批號：141128）；NO測試盒（南京建成生物工程研究所，批號：141024）。

1.3 儀器

D-37520低溫高速離心機（ThermoFisher）；Varioskan 全波長多功能酶標儀（Thermo Fisher Scientific）。

2 方法

2.1 藥對水提物制備

大黃黃芩藥對配伍比例依據源于經典方三黃瀉心湯中的大黃黃芩2:1的配比。準確稱取大黃30 g、黃芩15 g，加水約300 mL，浸泡0.5 h，用武火煎至沸騰后改用文火煎40 min。傾出藥液，加水約240 mL再煎25 min。合并藥液濃縮至100 mL，得0.45 g(生藥)/mL，置4 ℃ 冰箱保存備用, 于給藥前用蒸餾水以1∶0.5的倍比稀釋成0.45 g(生藥)/mL 和0.225 g(生藥)/mL。地塞米松片（陽性藥）用蒸餾水稀釋成0.75 mg﹒mL-1。

2.2 給藥、造模及取樣

雄性SD大鼠50只，適應性飼養1周后，隨機分為5 組，每組10只，分別為空白組、模型組、地塞米松組、4.5和2.25 g﹒kg-1大黃-黃芩藥對組。各給藥組動物灌胃預防性給藥連續7 d，每日早晚各1次，空白組和模型組給予等體積的蒸餾水。末次給藥前禁食不禁水8 h，末次給藥結束后，除空白組外各組大鼠經尾靜脈注射5 mg﹒kg-1LPS建立內毒素血癥模型，空白組注射等體積的生理鹽水。大鼠注射LPS 6 h后，用20% 烏拉坦（1.0 g﹒kg-1體重）進行麻醉，股動脈取血，室溫放置半小時后，以3500 rpm離心15 min，分離上層血清并分裝保存于-80℃超低溫冰箱，待檢。

2.3 ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量

采用ELISA法，嚴格按照試劑盒說明書的操作步驟檢測大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

2.4 化學比色法檢測血清中NO的含量

采用化學比色法，嚴格按照測試盒說明書的操作步驟檢測大鼠血清中NO的含量。

2.5 數據處理

采用SPSS 19.0軟件進行統計學處理，數據以x±S表示，組間顯著性差異采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 大黃-黃芩藥對對內毒素血癥模型大鼠血清中TNF-α的影響

由表1可知，與空白組比較，模型組大鼠血清中TNF-α的含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，4.5 g﹒kg-1大黃-黃芩藥對組可顯著降低模型大鼠血清中TNF-α的水平（P＜0.05）。

表1 大黃黃芩藥對對內毒素血癥模型大鼠TNF-α的影響(x±S，n=10)

3.2 大黃-黃芩藥對對內毒素血癥模型大鼠血清中IL-1β的影響

由表2可知，與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-1β的含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，4.5和2.25 g﹒kg-1大黃-黃芩藥對組可顯著降低模型大鼠血清中IL-1β的含量（P＜0.05）。

表2 大黃黃芩藥對對內毒素血癥模型大鼠IL-1β的影響(x±S,n=10)

3.3 大黃-黃芩藥對對內毒素血癥模型大鼠血清中IL-6的影響

由表3可知，與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-6的含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，4.5和2.25 g﹒kg-1大黃-黃芩藥對組可明顯降低模型大鼠血清中IL-6的水平（P＜0.05）。

表3 大黃黃芩藥對對內毒素血癥模型大鼠IL-6的影響(x±S,n=10)

注：與模型組比較，* P＜0.05，**P＜0.01

3.4 大黃-黃芩藥對對內毒素血癥模型大鼠血清中NO的影響

由表4可知，與空白組比較，模型組大鼠血清中NO的含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，4.5和2.25 g﹒kg-1大黃-黃芩藥對組可明顯降低模型大鼠血清中NO的水平（P＜0.01或P＜0.05）。

表4 大黃黃芩藥對對內毒素血癥模型大鼠NO的影響(x±S,n=10)

4 討論

內毒素血癥是由LPS入侵機體后引起的一類綜合性疾病，嚴重時甚至危及生命[3]。LPS進入機體后，經過一系列的炎癥反應最終導致炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6及NO的大量釋放，這些炎癥因子的大量釋放反過來又會進一步加重炎癥反應，造成機體的炎性損傷[4]。因此，通過抑制炎癥因子的釋放，是治療內毒素血癥的有效途徑之一。

大黃-黃芩是方劑中的經典藥對之一，兩者合用瀉火解毒，多用于的熱毒證的治療。研究發現大黃素可通過阻斷NF-κB炎癥通路，來減少炎癥因子的釋放達到緩解內毒素血癥的作用[5～6]。大黃酸也可通過抑制IκBα降解和p65蛋白的轉位來減少炎癥因子的分泌[7]。黃芩苷可減少炎癥因子的釋放[8]。黃芩素亦可抑制TNF-α、IL-6等炎癥因子的釋放[9]。現代研究表明，中醫熱毒證證型與內毒素血癥初期癥狀相似。因此大黃-黃芩藥對可用于內毒素血癥初期的治療。

本次實驗結果表明大黃-黃芩藥對能不同程度地減少內毒素血癥模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的釋放。研究表明過量表達的TNF-α可損傷內皮細胞和組織，誘導其他炎癥細胞因子表達，進一步刺激炎癥反應[10]。IL-1β和IL-6是白細胞介素的重要成員，機體組織內IL-1β和IL-6水平的過量升高能誘發多種炎性疾病[11～12]。NO是內毒素血癥中的重要炎癥介質，過量的NO也可促進炎癥反應的加劇以及多種炎癥因子的進一步釋放[13]。因此，抑制機體內TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的產生對于炎性疾病的治療和控制具有重要的意義。大黃-黃芩藥對對TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的抑制作用表明其具有良好的保護炎癥的作用。提示大黃黃芩配伍使用改善內毒素血證炎性損傷的作用機制可能是通過抑制TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的水平來實現的。

綜上所述，大黃-黃芩配伍后對內毒素血癥模型大鼠的炎性損傷有較好的保護作用，其作用機制可能是通過抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和NO釋放來實現的。

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