中國沙棘葉薄層色譜鑒別的提高研究

趙彩云，蘇錦松，劉川，張藝

沙棘葉收載于《四川省藏藥材標準》（2014年版），為胡頹子科植物中國沙棘（Hippophae rhamnoidesL.subsp.sinensisRousi）、云南沙棘（Hippophae rhamnoidesL.subsp.yunnanensis Rousi）的干燥葉，具有健脾消食，止咳祛痰和活血散瘀的功效，用于治脾虛食少，食積腹痛、咳嗽痰多、胸痹心痛、瘀血經閉及跌撲瘀腫[1]。前期研究表明，沙棘葉次生代謝產物主要為黃酮類成分，包括異鼠李素、山柰素和槲皮素及其苷類成分等，黃酮類化合物具有改善微循環、改變體內酶活性、降血脂、降膽固醇、抗自由基、抗氧化、增強免疫功能、抑菌、抗病毒和抗炎癥等藥理作用[2]。《四川省藏藥材標準》（2014年版）中沙棘葉的薄層鑒別項僅對槲皮素和異鼠李素兩種黃酮苷元成分進行定性鑒別，且異鼠李素拖尾現象較嚴重，見圖1。為了提高鑒別的準確性，本實驗以野生資源量大，中國特有的中國沙棘為研究對象，同時以槲皮素、異鼠李素以及山奈素三種黃酮苷元為對照品，研究建立了中國沙棘葉的薄層色譜鑒別法，以期提高現有法定標準中沙棘葉的薄層色譜鑒別方法。

圖1 《四川省藏藥材標準》（2014年版）中沙棘葉TLC圖

1 實驗材料

1.1 實驗樣品

共12 批次，采自四川、西藏及甘肅（見表1），經成都中醫藥大學民族醫藥學院張藝研究員鑒定其基原為胡頹子科沙棘屬中國沙棘 (H.rhamnoidesL.subsp.sinensisRousi)的葉片，新鮮葉片采集后立即用硅膠干燥。

表1 12批次中國沙棘葉樣品信息表

1.2 儀器

ZF-20D型暗箱式紫外分析儀（上海顧村電光儀器廠）；KQ-50B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Sartorius BP121s型電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；ULUP-I-10T型優普超純水機（成都超純科技有限公司）；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業儀器有限公司）。

1.3 試藥

槲皮素對照品（批號：MUST-150907，純度：99.35%）、山柰素對照品（純度：99.26%）和異鼠李素對照品（純度：99.13%），以上對照品均購自成都曼思特生物科技有限公司，其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 對照品溶液的制備 取槲皮素、山奈素、異鼠李素對照品適量，精密稱定，加甲醇超聲溶解，分別配置為0.468 mg﹒mL-1、0.256 mg﹒mL-1、0.196 mg﹒mL-1的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取中國沙棘葉粉末（過三號篩）約1.0 g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇40 mL，稱定重量，以70 ℃加熱回流提取1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。取續濾液20 mL置具塞錐形瓶中，加鹽酸3mL，在75 ℃水浴中加熱水解30 min，立即冷卻，濾過。取濾過液10 mL，蒸干，加水15 mL溶解，用乙酸乙酯萃取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯溶液，水浴蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。

2.1.3 顯色劑的制備 稱取三氯化鋁1 g，加乙醇100 mL溶解制成l%的三氯化鋁乙醇溶液。

2.1.4 TLC 鑒別 按照薄層色譜法（2015版《中國藥典》通則0502）試驗[3]，吸取對照品溶液1 μL、供試品溶液2 μL，分別點于同一實驗室自制的含3%醋酸鈉溶液制備的硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸（6 : 4 : 1.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1 %三氯化鋁試液，熱風吹干，置紫外光燈（365 nm）下觀察，結果見圖2。

圖2 中國沙棘葉TLC圖

2.2 方法耐用性考察

2.2.1 不同溫度的考察 分別考察了不同溫度（4 ℃、20 ℃、35 ℃）對薄層鑒別的影響，結果見圖3。

圖3 不同溫度條件考察的薄層色譜圖（UV365nm下檢視）

從圖3可知：在不同溫度4 ℃、20 ℃和35 ℃下，對照品溶液與供試品溶液薄層色譜圖斑點無明顯拖尾現象，均能實現分離，但溫度過低時易形成邊緣效應。相比較而言，20 ℃能達到很好的分離效果，說明該薄層鑒別方法的耐用性良好。

2.2.2 不同相對濕度的考察 分別考察了不同相對濕度（18%、32%、56%）對薄層鑒別的影響，結果見圖4。

圖4 不同濕度條件考察的薄層色譜圖（UV365nm下檢視）

從圖4可知，在低、中、高不同相對濕度18%、32%、56% 的條件下展開，對照品溶液與供試品溶液薄層色譜圖斑點無明顯拖尾現象，均能實現分離，相比較而言，32%能達到很好的分離效果，說明該薄層鑒別方法的耐用性良好。

2.3 不同批次中國沙棘葉的薄層色譜鑒別

按照上述確定的薄層鑒別條件，進行12批次不同產地中國沙棘葉的薄層色譜鑒別，結果顯示供試品溶液薄層色譜圖中，在與對照品溶液薄層色譜的相應位置上，顯示相同顏色的熒光斑點。色譜圖見圖5。

圖5 12批次不同產地中國沙棘葉的薄層鑒別色譜圖（UV365nm下檢視）

3 討論

3.1 展開劑的選擇

主要考察了3個展開系統：（1）三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸（6:4:1.5）；（2）三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（5:4:1）；（3）甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5:2:1)，結果表明，展開系統（2）中異鼠李素拖尾較嚴重，展開系統（3）中山柰素和異鼠李素未完全分開，綜合考慮，確定三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸（6:4:1.5）為中國沙棘葉的薄層色譜鑒別條件。

3.2 薄層板的選擇

主要考察了硅膠G板、聚酰胺薄膜和含3%醋酸鈉的硅膠G板對實驗的影響，硅膠G板的薄層色譜圖中山柰素和異鼠李素很難進行分離，聚酰胺薄膜的薄層色譜圖中對照品及供試品拖尾現象均較嚴重。

3.3 樣品溶液的制備

實驗結果表明，供試品溶液的薄層色譜圖中接近溶劑前沿的部分有較多的紅色斑點，猜測很有可能為沙棘葉中的葉綠素類等脂溶性成分，在后期質量標準的制定中，可考慮在樣品處理過程中增加石油醚除雜的操作。

本實驗利用三種黃酮類成分對中國沙棘葉進行薄層色譜的研究和分析，所建立的薄層色譜定性鑒別方法準確、可靠、適用性強，可以此對中國沙棘葉藥材進行科學的質量控制。

[1]四川省食品藥品監督管理局.四川省藏藥材標準（2014年版）[M].成都:四川科學技術出版社, 2014:87-91.

[2]曹緯國,劉志勤,邵云,等.黃酮類化合物藥理作用的研究進展[J].西北植物學報,2003,23(12): 2241-2247.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2015年版[S].北京:中國醫藥科技出版社.