玉米抗南方銹病性狀遺傳分析與連鎖分子標記的篩選

王文潔 周聯東 張瑞平 孫佩 劉經緯 王蕊

摘要?[目的]對玉米南方銹病性狀進行遺傳分析，篩選南方銹病基因連鎖的SSR引物標記，并進行初步定位。[方法]以抗南方銹病玉米自交系K381和感病自交系LX9801為材料，構建6個世代群體（P1、P2、F1、F2、B1CF1、B2CF1），對玉米南方銹病進行遺傳分析，利用SSR標記對南方銹病連鎖基因進行引物篩選，并利用篩選的分子標記對輔助抗南方銹病材料進行前景選擇。[結果] F2代分離群體抗病株與感病株比例符合3∶1分離比例，B2CF1 [（K381×LX9801）×LX9801]群體抗感株接近1∶1分離比例，推測其抗性基因為單一顯性基因控制的，與10.02區域內的2對SSR引物phi059和umc2018緊密連鎖，初步認為K381的抗南方銹病基因位于第10號染色體短臂上。[結論]引物phi059可以用于玉米抗南方銹病材料輔助選擇。

關鍵詞?玉米;南方銹病;SSR分子標記;基因定位

中圖分類號?S503.53文獻標識碼?A文章編號?0517-6611（2018）35-0100-03

2015年玉米南方銹病在河南南陽、駐馬店、周口、商丘等15個地（市）暴發流行，覆蓋全省主要玉米種植區，全省共計發生188.55萬hm2，占玉米種植面積的56.1%[1]。在流行年份，南方銹病能造成玉米大幅減產，嚴重時超過45%[2-3]。暴發流行時，除造成品質下降外，減產可達80%以上，甚至絕收[4]。南方銹病是一種暴發性、毀滅性病害，防治非常困難，最有效的方法是選擇抗病品種。由于該病害并非常年發生，因此常規育種過程中，在缺乏病害選擇的情況下，很容易造成抗病基因的丟失。這是目前生產上應用的玉米自交系大多數感染南方玉米銹病的主要原因之一，目前生產上大部分品種不抗南方銹病。分子標記技術的應用不受環境、時間、地點和病害發生與否的影響。該技術對目標基因的轉移可在早代進行準確、穩定地選擇，從而加速育種進程，提高育種效率。與常規育種相比，該技術可提高育種效率2～3倍。

目前在分子標記輔助玉米抗南方銹病育種方面也做了大量研究。2003年，陳翠霞等[5]以齊319×340的F2和BC1F1群體為材料，通過SSR-BSA分析，將齊319抗病基因RppQ定位在第10號染色體短臂上，與標記phi041和phi118連鎖，遺傳距離分別為2.45、3.33 cM。2009年，張斌[6]也利用齊319為供體親本，以南方玉米銹病感病自交系L189、DH4866、502、5003、鄭58、昌7-2、9801等為受體親本，通過回交育種，利用phi041和phi118這2個標記輔助選擇，得到了抗南方玉米銹病良好的BC4Fl代材料。李少博等[7]用引物phill8和P2輔助選擇，對骨干自交系京24進行抗南方銹病改良。譚華等[8]通過研究發現，利用引物phi048對南方玉米銹病抗病材料進行早代選擇是有效的，可淘汰大量感病家系，減輕田間工作量;利用分子標記輔助定向選擇結合抗病接種鑒定，能有效改良溫帶種質的抗銹性。

該研究為了利用分子標記輔助玉米抗南方銹病育種，利用抗南方銹病玉米自交系K381和感病自交系LX9801構建6個世代群體，對玉米南方銹病基因的連鎖標記進行進一步篩選。利用篩選的分子標記對輔助抗南方銹病材料進行前景選擇，結合田間鑒定驗證分子標記輔助選擇玉米抗南方銹病基因的選擇效果，以期為分子標記輔助玉米抗南方銹病育種工作提供參考。

1?材料與方法

1.1?分離群體的構建

田間試驗于2016年冬在河南省新鄉市農業科學院海南三亞南濱基地進行，室內分析在新鄉市農業科學院實驗室進行。

以抗南方銹病玉米自交系K381和感病自交系LX9801構建6個世代群體，30個P1（K381）、30個P2（LX9801）、30個F1（K381×LX9801）、386個F2群體、284個B2CF1 [（K381×LX9801）×LX9801]群體、198個B1CF1[（LX9801×K381）×K381]群體。

1.2?南方銹病接種方法

田間試驗于2016年冬在河南省新鄉市農業科學院海南三亞南濱基地進行，該地點為南方銹病高發區，在3～5片葉時人工接種1次，接種后3～5 d進行人工噴水，促使病原菌早發。

1.3?分子標記分析

采用2×CTAB法提取并純化DNA。參照已經發表的玉米分子標記連鎖圖，根據文獻報道抗南方銹病基因位于第10號染色體上，從Maize GDB（http：//www.maizegdb.org）上選取玉米第10號染色體連鎖群上的50對標記，利用抗感池進行多態性篩選，對抗感池間有多態性的標記再進行分離群體的連鎖分析。

PCR擴增反應在BIOER TC-96/G/H（b）型PCR儀上進行。反應總體積為20 μL，包括0.2 mmol/L dNTPs、0.25 μmol/L引物和20 ng模板DNA，加滅菌純水補足體積。PCR擴增程序為94 ℃預變性5 min;94 ℃40 s，60 ℃35 s，72 ℃45 s，30個循環;72 ℃延伸10 min。擴增產物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，染色過程在低速轉動的水平搖床上進行，方法為①10%乙醇+0.5%冰醋酸固定10～15 min;②0.2%硝酸銀滲透10～15 min;③用蒸餾水漂洗2次;④1.5%氫氧化鈉+0.4%甲醛顯色，直到顯出清晰條帶，終止顯色。結果照相分析。

1.4?抗感池分析

在父母本各取15株高抗、高感的DNA等量混合，組成DNA分析的抗、感基因池（Bulk R，Bulk S）。

2?結果與分析

2.1?分離群體的表現型

抗病指數按玉米南方銹病抗性全國統一記載，標準病級劃分見表1，6個世代群體抗性表現見表2，根據抗性表型鑒定結果發現P1（K381）、F1、B2CF1 [（LX9801×K381）×K381]群體均表現高抗;F1代正反交抗性無明顯差異，說明該抗性性狀受細胞質遺傳影響小;F2分離群體386個，扣除臨界抗性無法分清等級的12個，其抗感表現明顯呈單峰偏態分布（圖1），抗、感株比例為283∶91，經χ2檢驗抗感株比例符合3∶1，B1CF1[（K381×LX9801）×LX9801]群體284個，抗、感株比例（148∶129）接近1∶1，符合孟德爾單一顯性基因分離規律，推測在該分離群體中南方銹病的抗性為單一顯性基因控制。

2.2?分子標記連鎖分析

選取均勻分布在玉米10號染色體短臂上的50對標記，通過抗感反應池進行多態性篩選（圖2），其中有5對引物存在多態性差異。

利用抗感池間有差異的5對SSR標記對F2分離群體、B2CF1[（K381×LX9801）×LX9801]群體再進行分離群體的標記連鎖檢測，結果發現位于第10號染色體的2對SSR標記與抗病基因表現一定的連鎖關系（圖3、4），其中位于10.02區域內的1對SSR標記phi059與抗病基因緊密連鎖，通過檢測該標記在F2分離群體分子標記帶型（K381型、LX9801型）接近3∶1的分離比例;B1CF1[（K381×LX9801）×LX9801]群體標記帶型（K381型、LX9801型）接近1∶1的分離比例。

3?小結

該研究通過對抗性材料K381/LX9801構建的6個世代群體遺傳分析，F2代分離群體抗病株與感株比例符合3∶1，B2CF1 [（K381×LX9801）×LX9801]分離群體抗感株比例接近1∶1，推測其抗性基因為單一顯性基因控制的，利用F2代分離群體進行SSR分子標記連鎖分析，初步認為材料K381的抗南方銹病基因與標記umc2018和phi059緊密連鎖，其中phi059標記與劉章雄等[3]以玉米南方型銹病免疫自交系 P25為材料獲得的研究結果一致。2個引物均位于第10號染色體的10.02區，所以初步推斷材料K381的抗南方銹病基因位于第10號染色體短臂上，這與陳翠霞等[5]2003年研究結果一致。

參考文獻

[1] 徐永偉，于思勤，王江蓉，等.2015年河南省玉米南方銹病暴發流行原因分析及防治對策探討[J].中國農技推廣，2016，32（8）：71-73.

[2] RAID R N，PENNYPACKER S P，STEVENSON R E.Characterization of?Puccinia polysora epidemics in Pennsylvania and Maryland[J].Phytopathology，1988，78（5）：579-585.

[3] 劉章雄，王守才，戴景瑞，等.玉米P25自交系抗銹病基因的遺傳分析及SSR分子標記定位[J].遺傳學報，2003，30（8）：706-710.

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[5] 陳翠霞，邢全華，梁春陽，等.南方玉米銹病抗病基因的定位及不同遺傳背景對基因標記的比較分析[J].遺傳學報，2003，30（4）：341-344.

[6] 張斌.分子標記輔助選擇玉米兼抗粗縮病和南方銹病的育種材料[D].泰安：山東農業大學，2012.

[7] 李少博，宋偉，王鳳格，等.分子標記輔助玉米自交系京24抗南方銹病的改良[J].分子植物育種，2012，10（4）：440-445.

[8] 譚華，鄒成林，鄭德波，等.分子標記輔助選擇抗南方玉米銹病材料[J].廣東農業科學，2016，43（7）：6-10.