基于SSR的高粱光敏特性分析

牛皓 平俊愛 張福耀 呂鑫 杜志宏 李慧明 王玉斌

摘要?[目的]探明控制高粱抽穗期基因的遺傳機理，為高粱品種選育提供新思路新方法。[方法]利用已知抽穗性狀的3個高粱材料晉粱五、Ma、IS722，對144對SSR引物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，分析差異，篩選光敏感特異性引物。[結果]有4對引物產生特異性條帶，分別為xtxp217、xtxp12、xtxp15、xtxp4，且片段大小在100 bp左右，其中xtxp217位于10號染色體、xtxp12位于4號染色體、xtxp15位于5號染色體、xtxp4位于2號染色體。[結論]該研究為后續對高粱雜交種進行光敏鑒定提供了基礎。

關鍵詞?高粱;光敏感;SSR

中圖分類號?S514文獻標識碼?A文章編號?0517-6611（2018）35-0097-03

高粱是一種起源于東非的熱帶短日照單子葉C4植物，自8 000多年前在埃塞俄比亞和蘇丹被馴化后作為食物、飼料、纖維和燃料被廣泛種植在全球范圍內的不同氣候帶[1]。由于高粱具有高產、適應性強、抗旱、耐鹽、耐堿等特性，因而被認為是未來最有價值的作物[2-3]。時至今日在西非和中非，高粱依然作為大宗的進口糧食來保障數百萬人民的溫飽[4]。高粱的種類比較廣泛，包括飼草高粱、釀造高粱、糖高粱等，這些不同的高粱分類一定程度上是由影響高粱抽穗期的環境因素決定的。

高粱抽穗期通常用播種到抽穗的天數來表示[4]。高粱抽穗期的合理調控對現代育種工作的成效至關重要，特別是作為青貯飼料用途的飼草高粱，對光照條件要求比較嚴格，當生長環境的光照時長超過12.2 h則不抽穗，始終維持營養生長狀態，生物產量比非光敏飼草高粱要高，同時牲畜的適口性和消化率較普通高粱好[5-10]。高粱全基因組測序工作已完成，分子輔助育種技術的應用對了解抽穗期的調控基因和調控機理進而實現“訂單化”育種有著重要的意義[11-14]。筆者以3個具有代表性的高粱材料為研究對象，提取DNA，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳對144對與高粱抽穗期相關的SSR引物進行鑒別，分析差異，篩選光敏感特異性引物，為選育光敏型飼草高粱提供新思路、新方法。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?高粱材料。3份高粱材料，分別為釀造粒用高粱晉粱五，飼草高粱IS722，光敏感普通高粱Ma。

1.1.2?SSR引物。通過查閱文獻共搜集到144對分布于高粱10條染色體上的SSR引物，其中有111對明確位置，另有33對沒有查詢到具體定位。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成（表1）。

1.2?方法

1.2.1?育苗。將晉粱五、Ma、IS722這3個材料分別種植于鋪有營養土的96孔育苗盤中，澆足底墑水，待3～4片葉時，用剪刀剪下足量葉片置于2 mL離心管中，液氮速凍后備用。

1.2.2?DNA提取。3個材料DNA提取是采用生工生物工程（上海）股份有限公司生產的Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒完成的，經過純度和濃度檢測后置于-20 ℃冰箱保存待用。

1.2.3?PCR擴增。擴增反應在Thermal Cycler C1000 touch擴增儀上進行，PCR反應總體系是10 μL，DNA模板1 μL，前后引物共1 μL，Taq PCR Master Mix 3 μL，ddH2O補足10 μL。PCR反應體系為94 ℃預變性4 min;94 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min，共34個循環;72 ℃最后延伸10 min。4 ℃待機備用。

1.2.4?聚丙烯酰胺凝膠電泳。將晉粱五、Ma、IS722這3個高粱恢復系材料，按照此順序組成1組，每組對應1對引物。電泳版用雙蒸水清洗瀝干，1%瓊脂糖封底待用;30%的丙烯酰胺溶液15 mL，10×TBE溶液6 mL，雙蒸水24 mL，20%過硫酸銨300 μL，TEMED溶液30 μL，各成分稱量好，待封底瓊脂糖凝固后，灌膠，點樣，電壓220 V，100 min。

試驗選用生工生物工程（上海）股份有限公司50～1 000 bp DNA Ladder-H2作為參照，跑膠結束后用干凈玻璃板鋪平，拍照分析。

2?結果與分析

通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結果出現多態性條帶的共96組即96對引物，與maker對照出現特異性條帶的引物共有4對，其余組引物并未出現明顯多態性。

這4對引物分別為xtxp217、xtxp12、xtxp15、xtxp47。對應序列分別為F：5′-GGCCTCGACTACGGAGTT-3′，R：5′-TCGGCATATTGATTTGGTTT-3′;F：5′-AGATCTGGCGGCAACG-3′，R：5′-AGTCACCCATCGATCATC-3′;F：5′-CACAAACACTAGTGCCTTATC-3′，R：5′-CATAGACACCTAGGCCATC-3′;F：5′-CAATGGCTTGCACATGTCCTA-3′，R：5′-GGTGCGAGCTAGTTAAGTGGG-3′。

3?結論與討論

結果表明，產生特異性條帶的引物分別為xtxp217、xtxp12、xtxp15、xtxp4，且片段大小在100 bp左右，其中xtxp217位于10號染色體、xtxp12位于4號染色體、xtxp15位于5號染色體、xtxp4位于2號染色體。國外科學家對高粱的前期遺傳研究揭示了4個與開花時間（成熟度）相關的遺傳位點，命名為Ma1、Ma2、Ma3、Ma4，其分別位于高粱的第6號、2號、1號和10號染色體上[15-19]。最近又發現了另外2個能增加光周期敏感性，并且能延長飼草及高生物量高粱雜交種營養生長時長的基因Ma5、Ma6[20]。該研究將篩選出的這4對特異性SSR引物用于后代材料的表型鑒定，通過實驗室“預判”就可得出材料的抽穗性狀，省去田間種植鑒別環節，節省育種的成本，縮短育種時間，提高育種效率。

隨著高粱全基因組測序完成和遺傳圖譜及物理圖譜的不斷完善，通過分子輔助育種手段就可以進一步明確與高粱抽穗期相關的基因性狀，這將在作物改良中發揮巨大的作用。另外，隨著全球煤炭、石油和天然氣等不可再生能源儲量的日趨減少，生物質能源的開發和利用已經成為全球科研焦點，而通過生物技術對高粱抽穗期進行調控進而選育出的高生物量、強抗逆性、種植范圍廣、乙醇轉化率高等優勢品種，必將成為生物質能源必不可少的原材料。

因此，高粱抽穗期基因表達的研究和控制，對于培育飼草高粱和對木質素生物燃料含量要求高的生物質高粱而言具有重要的意義[17，21]。

參考文獻

[1] 王燕.高粱抽穗期基因Ma1和Ma3的分子進化及抽穗期的QTL分析[D].北京：中國農業大學，2015.

[2] ROONEY W L，BLUMENTHAL J，BEAN B，et al.Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock[J].Biofuels Bioprod Bioref，2007，1（2）：147-157.

[3] VERMERRISM W，SABALLOS A，EJETA G，et al.Molecular breeding to enhance ethanol production from corn and sorghum stover[J].Crop Sci，2007，47：142-153.

[4] BHOSALE S U，STICH B，FREDERICK H，et al.Association analysis of photoperiodic flowering time genes in west and central African sorghum[Sorghum bicolor（L.）Moench][J].BMC Plant Biology，2012，12：1-10.

[5] LIN Y R，SCHERTZ K F，PATERSON A H.Comparative analysis of QTLs affecting plant height and maturity across the Poaceae，in reference to an interspecific sorghum population[J].Genetics，1995，141（1）：391-411.

[6] NIANGADO O.The state of millet diversity and its use in West Africa[C]//COOPER H D，SPILLANE C，HODGIN T.Broadening the genetic base of crop production.Rome：IPGRI/FAO，2001：147-157.

[7] VAKSMAN M，TRAO S，NIANGADO O.Le photopériodisme des sorghos africains[J].Agriculture et dévélopment，1996，9：13-18.

[8] CLERGET B，DINGKUHN M，GOZ E，et al.Variability of phyllochron，plastochron and rate of increase in height in photoperiodsensitive sorghum varieties[J].Ann Bot，2008，101（4）：579-594.

[9] HAUSSMANN B I G，BOUREIMA S S，KASSARI I A，et al.Mechanisms of adaptation to climate variability in West African pearl millet landraces：A preliminary assessment[J].SAT ejournal，2007，3（1）：1-3.

[10] SEARLE I，COUPLAND G.Induction of flowering by seasonal changes in photoperiod[J].EMBO J，2004，23（6）：1217-1222.

[11] THOMAS B，VINCEPRUE B.Photoperiodism in plants[M].2nd edition.California：Academic Press，1997.

[12] MOURADOV A，CREMER F，COUPLAND G.Control of flowering time：Interacting pathways as a basis for diversity[J].Plant cell，2002，14（S1）：111-130.

[13] SIMPSON G G，DEAN C.Arabidopsis，the Rosetta stone of flowering time？[J].Science，2002，296：285-289.

[14] IZAWA T，TAKAHASHI Y，YANO M.Comparative biology comes into bloom：Genomic and genetic comparison of flowering pathways in rice and Arabidopsis[J].Curr Opin Plant Biol，2003，6：113-120.

[15] HENDERSON I R，DEAN C.Control of Arabidopsis flowering：The chill before the bloom[J].Development，2004，131（16）：3829-3838.

[16] BURLE I，DEAN C.The timing of developmental transitions in plants[J].Cell，2006，125（4）：655-664.

[17] MURPHY R L，KLEIN R R，MORISHIGE D T，et al.Coincident light and clock regulation of pseudoresponse regulator protein 37（PRR37）controls photoperiodic flowering in sorghum[J].PNAS，2011，108（39）：16469-16474.

[18] ROONEY W L，AYDIN S.Genetic control of a photoperiodsensitive response in Sorghum bicolor （L.）Moench[J].Crop Sci，1999，39：397-400.

[19] KOURESSY M，NIANGADO O，DEMBL T，et al.La sélection de sorghos photopériodiques[M]//BACCI L，REYNIERS F N.Le futur des céréales photopériodiques pour une production durable en afrique tropicale semiaride.Montpellier：CeSIA/CIRAD，1998：247-262.

[20] AYDIN S，ROONEY W L，MILLER F R.Identification and characterization of the Ma5 and Ma6 maturity loci in sorghum[C]//Proceedings of the international conference on genetic improvement of sorghum and pearl millet.Lubbock，USA：INTSORMIL and ICRISAT，1997：641-642.

[21] CHILDS K L，CORDONNIERPRATT M M，PRATT L H，et al.Genetic regulation of development in Sorghum bicolo.VII.ma3R flowering mutant lacks a phytochrome that predominates in green tissue[J].Plant Physiol，1992，99（2）：765-770.