燕麥花藥組織培養影響因子研究進展

田娟 張曼 董玉迪 孫墨可 王春龍 沙莉 任長忠

摘要?燕麥花藥組織培養受各種因子的影響，從基因型、供體植株生長條件、花藥的選擇、預處理、培養基、培養條件幾個方面對國內外燕麥花藥組織培養研究進展進行綜述，以期為燕麥花藥組織培養提供參考。

關鍵詞?燕麥;花藥組織培養;影響因子

中圖分類號?S188+.2文獻標識碼?A文章編號?0517-6611（2018）35-0011-03

花藥組織培養是用植物組織培養技術把發育到一定階段的花藥通過無菌操作技術接種在人工培養基上，以改變花藥內花粉粒的發育程序，誘導其分化，并連續進行有絲分裂，形成細胞團，進而形成一團無分化的薄壁組織——愈傷組織，或分化成胚狀體，隨后使愈傷組織分化成完整的植株。花藥培養育種具有縮短育種年限、快速穩定變異性、提高選擇效率等優點[1]。在小麥[2-3]、水稻[4-5]、烤煙[6]、辣椒[7-8]等的育種實踐中，花培技術已顯示了其應用價值。在國內，關于燕麥花藥組織培養的報道很少，只有孫敬三等[9]用裸燕麥花藥建立了分散好、生長快的單倍體懸浮細胞培養物，現在報道的關于燕麥的組織培養大多是子房[10]、穎片[11]、幼葉[12]、頂端分生組織[13-14]、幼穗[15]、幼胚[16-17]、成熟胚[18-20]、種子和根[21]等。就國外而言，1980年Chung[22]報道了燕麥花藥培養中有愈傷組織的發生;第1個從燕麥花藥培養中獲得植株的是Rines[23]，他報道了一個燕麥品種CV培養65 000余個花藥，其中2 627個產生愈傷組織，獲得一個單倍體和二倍體植株;Polsoni[24]1991年在燕麥中獲得一些愈傷組織，但沒有獲得植株;Sun等[25]獲得12株綠色植株和一個白化苗植株。以上研究表明用燕麥作花藥組織培養是可行的，但是成功率比較低，燕麥屬植物的花藥組織培養比較難。之所以成功率低、比較困難是因為影響愈傷組織發生的因素很多，該研究就國內外燕麥花藥組織培養研究進展，從基因型、供體植株生長條件、花藥的選擇、預處理、培養基、培養條件等方面進行綜述，以期為燕麥花藥組織培養提供參考。

1?基因型

供體植株的基因型是影響花藥和花粉培養的關鍵因素， 不同基因型的植株對培養的反應不同，表現為是否可誘導愈傷組織的生成，生成愈傷組織的多少和大小，以及綠苗分化、白化苗的產生等。芬蘭農業研究中心的Kiviharju等[26]對44個燕麥品種（Avena sativa L.）、6個裸燕麥（A sativa L.）、15個野生燕麥（Avena sterilis L.）、5個種內雜交（A.sativa.×A.sativa.）和2個種間雜交（A.sativa.×A.sterilis.）進行研究，結果表明：野生燕麥的出愈率優于裸燕麥且只有野生燕麥獲得再生植株，反應了燕麥花藥組織培養受基因型影響很大。2005年楊才等[27]研究發現燕麥品種間出愈率差異在 0.0%～48.5%，且 F1代出愈率與雙親出愈率的高低相關性強。Kiviharju等[28]對14個燕麥品種進行花藥組織培養，結果只有6個基因型獲得再生植株。Noga等[29]對21個不同燕麥雜交組合進行研究，結果表明愈傷組織大小與基因型顯著相關，單倍體胚胎的萌發能力在燕麥基因型之間有顯著差異。

2?供體植株生長條件

即使基因型相符，供體植物的生理狀態對花藥組織培養也有影響，這取決于生長條件。有報道指出，一些植物在正常生長季節生產的田間材料要比溫室培養的材料好[30]、健康、有活力的供體植株對于成功的花藥/小孢子培養是必不可少的[31-32]。有時只有在控溫、一定光周期和光強的環境條件下，花藥才會有反應[33]。Kiviharju等[34]發現，同一燕麥品種（Aslack）在相同培養基、培養條件下的綠苗率不同，最可能的原因是供體植株生長條件不同引起的，供體植株培養時的溫度、水分等都相同，唯一不同的是每天有數小時的自然光照射，在61°S隨著季節的變化，自然光發生變化。

3?花粉（花藥內的小孢子）的發育時期

小孢子發育階段是誘導花粉胚發育的關鍵階段。在小孢子發生的某些階段，小孢子并沒有完全參與配子發育，可以誘導胚胎發生[35];最佳敏感的發育階段因物種而不同，在對植物進行廣泛的研究中，第1次有絲分裂是雄性激素誘導的最佳時期[36]。王子霞等[11]選取花粉處于單核中晚期燕麥穗子的穎片進行離體培養，獲得再生植株。Sidhu等[37]選取處于單核中期的燕麥幼穗進行小孢子離體培養，首次從離體燕麥小孢子中獲得再生綠色植株。Ferrie[33]以燕麥2000QION43品系為材料，選取單核晚期至雙核早期的幼穗獲得愈傷組織和再生植株，通過以上研究發現，燕麥誘導胚胎發生的最佳小孢子發育時期是單核中后期至雙核早期。

4?預處理

4.1?冷處理

1998年Kiviharju等[38]對燕麥Stout在4 ℃條件下處理0、7、14、21、28 d，結果處理7 d的愈傷組織最多，達到6.3%，表明7 d冷處理對Stout 的出愈水平略有提高;Sidhu等[37]對燕麥小孢子進行6～9周的4 ℃冷處理，獲得2棵綠苗和15棵白化苗，研究發現，冷處理時間與多細胞結構產生的數量呈正相關，但長期的冷處理可能導致白化苗頻率升高。Ferrie等[33]研究表明，使用0.3 mol/L甘露醇預處理收集的分蘗幼穗，在4 ℃下保持7 d，可產生比用水處理的分蘗獲得更多的1～2 mm 胚胎，盡管用2種方法處理后愈傷組織發育的數量沒有顯著差異，但是甘露醇處理比水處理產生的綠苗增多，且白化苗病株減少。

4.2?熱處理

Kiviharju等[38]在32 ℃條件下對分離出的花藥處理5 d，裸燕麥WW18019（A sativa L.）和野生燕麥（Avena sterilis L.）CAV264815出愈率比較好。以后一些相關研究人員都繼續做相關處理[34，39]。

5?培養基

燕麥花藥培養效率的提高， 在很大程度上依賴于培養基成分、 激素配比以及培養基pH不同來實現的，可以說培養基的改良一直處于主導地位。

5.1?基礎培養基

花藥組織培養使用的基本培養基有大量元素、微量元素、維生素、糖類和生長因素等。培養基的組成在胚胎發生中起著主要的作用。經過前人的多年研究，N 6、KFWC、MS、W 14、FHG、TM、NLN、190-2、B5 等都用于燕麥花藥培養的基本培養基[29-40]。其中常用且效果比較好的誘導培養基有KFWC、W 14和190-2，再生培養基一般為MS和W14。Ferrie等[33]以燕麥2000QION43品系為材料，對W 14、FHG、TM、NLN、KFWC這 5種誘導培養基進行燕麥花藥培養對比試驗，結果表明相較于其他培養基，對于燕麥花藥組織培養KFWC、W 14培養基表現效果比較好。對MS，W14和B5這3種再生培養基進行比較，W14綠苗率最高（88%），其次是MS（82%），最差是B5（73%），相比之下W14的白化苗率最低。

5.2?激素配比及附加成分

Kiviharju等[26]報道燕麥栽培種、野生種以及它們的雜交種的花藥培養，研究 2，4-D 、 KT對植株再生能力的影響，結果表明生長激素抑制燕麥（Avena sativa L）愈傷的出現，而在裸燕麥（A.sativa L.）、野生燕麥（Avena sterilis L.）和雜交后代（A.sativa.×A.sterilis.）中加入1.0 mg/L 2，4-D的誘導培養基會促進愈傷組織的出現;Rines[16]在未授粉子房的培養中，認為2 ，4-D 和 KT 聯合作用反而降低愈傷組織的誘導率;Kiviharju等[39]研究不同激素及附加成分對再生植株的影響，獲得22株綠苗，其中13株存活（11株單倍體，2株雙單倍體），37株白化苗，結果表明：誘導培養基中加入1.0 mg/L 2，4-D和0.1 mg/L KT時出愈率最高，促進愈傷組織的分化。但是6-BA能夠促進白化苗的產生。與蔗糖相比，麥芽糖作為碳源，WW18019和Stout的出愈率更高;Kiviharju等[34]以Lisbeth 和Aslack為材料，以W14為基本培養基，對比30多個添加不同激素配比和附加成分的組合，發現與僅含2，4-D和KT相比，添加 2，4-D、BAP、乙烯利、L半胱氨酸和肌醇能夠提高植株的再生率;Noga等[29]比較不同培養基對胚胎再生能力的影響，設置了不同激素配比，其中大多數單倍體胚胎在1mg/L ZEA+0.5 mg/L NAA中能夠再生。以上研究證明不同燕麥品種在同一激素配比中誘導結果不同，同一燕麥品種在不同培養基上反應結果也不同，所以不同燕麥品種有其最適的培養體系。

5.3?培養基的pH

培養基的pH影響植物體細胞胚胎誘導和發育[41]。有報道指出，燕麥花藥組織培養的pH為5.8或者6.0[34，39];Sidhu等[37]指出使用pH 8.0的培養基比pH 5.8的培養基誘導出更多的愈傷組織，但是高pH培養基不支持細胞的持續生長，促進愈傷組織的褐化。Ferrie等[33]認為培養基pH和愈傷組織的數量相關，較高的pH水平（7.0和7.5）產生的愈傷組織的數量和質量明顯優于較低的pH水平（4.5、5.0、5.8）。

6?培養條件

6.1?培養溫度

體外胚胎發生可受小孢子的分離后條件的影響。許多研究都集中在適當的培養溫度及其持續時間，不同物種之間也存在差異。Polsoni[24]研究發現，在25～30 ℃下燕麥花藥愈傷組織的誘導比較好，Kiviharju 等[34]發現誘導愈傷組織的溫度可以達到30 ℃，30 ℃時出愈率最高，但是28 ℃是綠苗的最佳溫度。Ferrie等[33]研究表明，在28 ℃下燕麥小孢子培養具有較高的再生率。

6.2?培養光照

Kiviharju等[34]指出，燕麥Lisbeth在誘導期，黑暗培養比弱光培養[16/8，40 μmol/（m2·s）]提高愈傷組織的出愈率和再生苗率，但燕麥Aslack在黑暗和弱光下培養沒有統計學上的差異。表明基因型對光反應是有差異的。Ferrie等[33]指出在誘導期間的黑暗對綠色植物生產更有效。

6.3?培養密度

小孢子和花藥的密度是培養中的一個重要因素，它影響愈傷組織的質量和數量。當用小孢子培養時，小孢子密度一般為1×106個/mL時能夠獲得的愈傷組織較多，質量最好[33，36];當用花藥直接培養時，一般花藥的密度是30個/皿（直徑3.5 cm）[34，38-39]。

7?討論及展望

燕麥花培品種與常規育種品種相比不僅縮短了育種年限，而且品質好，但在實際生產中采用花藥單倍體育成的燕麥新品種很少，沒能夠充分發揮其優勢。其原因是影響燕麥花藥組織培養的因子很多，存在顯著的基因型依賴性、出愈率差、綠苗分化率較低、褐化、白化、玻璃化現象嚴重等。同時單倍體加倍率不高和與常規育種技術結合程度不高，也是限制其發展的主要因素。因此，大范圍收集、篩選具有優良花培特性的燕麥基因型材料是發展花藥培養技術的關鍵所在;提高花培效率，優化培養流程和培養條件，加強技術和育種材料的交流能夠推動花藥培養技術的進一步發展;最后加強與誘變技術、遠緣雜交、分子標記輔助選擇、轉基因等技術相結合，將會提升花藥的培養效率。隨著下一代測序技術、高通量篩選突變體等現代分子生物學技術的迅猛發展，燕麥雙單倍體材料（DH）的創制就顯得尤為重要。

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