發酵乳中乳酸菌計數不確定度的評定

◎ 馮秀娟，鄧 軍，高俊峰

（寧夏自治區食品檢測中心，寧夏 銀川 750000）

乳酸菌是一類可發酵糖主要產生大量乳酸的細菌的通稱[1]。GB19320-2010中規定發酵乳產品中的乳酸菌數不得低于1×106CFU/g（mL），乳酸菌的含量是評價產品對于人們營養與健康作用的重要指標[2]，因而測量結果的可用性值得高度關注。一切定量結果都不可避免具有不確定度，測量不確定度是根據所用到的信息，表征賦予被測量量值分散性的非負參數。目前，GB/T27025-2008《檢測和校準實驗室能力的通用要求》（ISO/IEC17025-2005《檢測和校準實驗室能力認可準則》）[3-4]指出：適當時，要對測量結果的不確定度進行評定。CNAS-CL09-2013《檢測和校準實驗室能力認可準則在微生物檢測領域的應用說明》中也指出：在微生物檢測領域，某些情況下，應對測量不確定度進行合理的評估[5]。《實驗室資質認定評審準則》中對不確定度也有要求：當不確定度影響對結果符合性的判定時，報告中還需要包括不確定度的信息。本研究依據最新版GB4789.35-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》[1]的規定對發酵乳中乳酸菌總數進行測定。為保證數據準確可靠，可根據JJF1056.1-2012《測量不確定度評定與表示》與SN/T4091-2015《食品微生物學測量不確定度評估指南》[6-7]中有關規定對乳酸菌總數進行不確定度分析，找出乳酸菌檢測過程中的關鍵控制點[8]，為驗證實驗室對微生物的檢測、計數的準確度和精密度方面的能力提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品、儀器與培養基

樣品：市售酸奶。

儀器：生化培養箱（型號：BSP-250），冰箱，均質器，無菌均質袋，立式自動壓力蒸汽滅菌器（GR850DF，致微儀器有限公司），厭氧袋，天平，無菌試管，無菌吸管，生理鹽水。

培養基：MRS培養基，MC培養基。

1.2 檢測方法

1.2.1 取樣與稀釋

樣品的全部制備過程均應遵循無菌操作程序。稱取酸奶樣品25 g于裝225 mL生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1～2 min制成1∶10的樣品勻液。用1 mL無菌吸管吸取1∶10的樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于裝有9 mL生理鹽水的無菌試管中，制成1∶100的樣品勻液，按上述操作順序，做10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1次1 mL滅菌吸管。

1.2.2 稀釋倍數選擇

根據平常實驗經驗，酸奶中乳酸菌計數（GB4789.35-2010版標準）一般選擇10-5、10-6稀釋度，根據GB4789.35-2016，本實驗選擇10-6、10-7、10-83個稀釋度。

1.2.3 傾注平板、培養與計數

將冷卻至48 ℃的MRS瓊脂培養基傾注入有稀釋液的平皿中，轉動平皿混勻。（36±1）℃厭氧培養（72±2）h。培養后計數平板上的所有菌落數。

2 結果與分析

2.1 結果報告原則

選取菌落數在30～300 CFU、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數，單位CFU/mL。

2.2 建立數學模型

由于只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內，因此計算該稀釋度平板上的菌落數乘以該稀釋度，即為乳酸菌計數結果，公式為：

式（1）中：N為樣品中菌落數；X為平板上的菌落數；d為稀釋度。

2.3 不確定度的來源

檢測中不確定度的來源主要有：樣品本身的均勻性、取樣的重復性、操作者、培養時間、設備、培養基、試劑及玻璃量具等。與一般的側量比較，微生物同一樣品重復測量的結果相差極大，即結果的分散性較大。隨機效應帶來的樣本重復性偏差是獲取測量不確定度的主要因素，即A類評定。本實驗主要采用A類評定測量不確定度，同時考慮了B類不確定度對合成不確定度的貢獻。

2.4 不確定度的評定

2.4.1 同一樣品的重復測量結果的不確定度評定

依據GB 4789.35-2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》進行檢驗，在重復性條件下對同一個酸奶樣品進行了10次獨立性測試，由于乳酸菌的數量分布在108和109數量級，計算出的樣本標準差很大，因此對實驗數據取對數后進行計算[9-12]，結果和中間計算值，見表1。

表1 重復測量結果和中間計算值表

合成標準不確定度等于1倍的標準偏差，即：

根據置信概率p=95%和自由度ν=9，由t分布表得到包含因子k=2.26，于是得：對數計算結果：

2.4.2 一組樣品的重復測定結果的不確定度評定

隨機選取10份酸奶樣品，各樣品由不同人員進行試驗，同一樣品由同一人員進行2次試驗。中間計算值及對數計算結果，見表2。

表2 10份酸奶樣品乳酸菌測量結果及中間計算值表

合并樣本標準差：

因為每一樣品測量2次，所以2次測量結果平均值的實驗合并標準差為：

根據置信概率p=95%和自由度ν=10，由t分布表得到包含因子k=2.23，于是得：

2.4.3 B類不確定度的評定

主要考慮樣品制備過程中稱量、玻璃量具（含溫度校正）、稀釋過程、接種過程等引入的不確定度。

2.4.3.1 樣品制備過程中引入的相對標準不確定度

（1）稱量。所用天平最大量程為1 000 g，允許誤差為0.1 g，稱取25.0 g樣品，測量儀器最大允許誤差導致的不確定度屬于均勻分布，所以由天平稱量引入的相對標準不確定度為：

（2）玻璃器皿及溫度所用250 mL無菌量筒量取225 mL無菌生理鹽水緩慢加入稱量好的25.0 g樣品中，根據JJG196-2006[13]中規定，20 ℃時量出式量筒的容量允許差為2.0 mL，按照三角分布考慮，k=6，由此估算量筒的允許誤差引入的相對標準不確定度為：

在實驗室室溫為25 ℃時取樣，水的膨脹系數為2.1×10-4/℃，按均勻分布溫度引入的相對標準不確定度為：

（3）均質器將制備好的樣品進行均質，每個樣品按GB4789.35-2016中規定均質速度和時間進行均質，可認為由均質引入的不確定度可忽略不計。

樣品制備過程中引入的不確定度由電子天平、量筒和溫度產生的相對標準不確定度合成，故：

2.4.3.2 樣品稀釋過程中引入的相對標準不確定度

樣品稀釋過程中引入的不確定度主要是由1 mL流出式吸量管（B級）引入的不確定度。按照JJG196-2006《常用玻璃量具檢定規程》的要求，均有相應的最大允差，按照三角分布考慮，k=，由此估算相對不確定度分量，見表3。本實驗過程中，試驗溫度與鑒定證書的溫度一致，

因此溫度引起的容量瓶體積不確定度可忽略。

表3 樣品稀釋過程中量具校準引起的不確定度表

2.4.3.3 樣品接種過程中引入的相對標準不確定度

選取適宜稀釋度的樣品1 mL加入無菌培養皿中，實際取樣1 mL待測樣品時的相對標準不確定度：

2.4.3.4 合成不確定度

B類各相對標準不確定度分量，見表4。

表4 相對標準不確定度分量表表

B類合成不確定度：

2.4.4 合成A類與B類不確定度

（1）同一樣品重復測量

相對A類不確定度B類的貢獻為：

（2）一組樣品的重復測定

合成不確定度：

相對A類不確定度B類的貢獻為：

3 討論

通過本次對乳酸菌不確定度的評定可知，影響乳酸菌檢測的因素很多，除樣品制備過程中量具、培養條件、培養基等外，主要表現為同一樣品同一人重復測定的檢測結果與同一組樣品平行測定的結果發散性較大，即發散是引起不確定度的主因，而B類不確定度占同一樣品重復性檢測所引起不確定度的24%，占一組樣品合并樣本標準差引起不確定度的13%。由此可見，B類不確定度對乳酸菌檢測的合成不確定度的貢獻比最大分量的1/3還小，可忽略不計。因此，日常工作中只需要考慮重復檢測所引入的不確定度。與此同時，為節省時間、降低成本，當樣品檢測結果發散性很大時，可采用合并樣本標準差求檢驗結果的不確定度，根據每次新積累的實驗數據，重新計算合并樣本標準差，更新不確定度的取值范圍。

[1]國家食品藥品監督管理總局.GB4789.35-2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗[S].北京：中國標準出版社，2016.

[2]謝繼志，肖宏彬.酸奶中乳酸菌數及酸度的檢測與評價[J].中國乳品業，2002，30（1）：22-25.

[3]全國認證認可標準化技術委員會.GB/T27025-2008檢測和校準實驗室能力的通用要求[S].北京：中國標準出版社，2008.

[4]全國認證認可標準化技術委員會.ISO/IEC17025-2005中國實驗室國家認可委員會檢測和校準實驗室能力認可準則[S].北京：中國標準出版社，2005.

[5]中國認證認可標準化技術委員會.CNAS-CL09-2013檢測和校準實驗室能力認可準則在微生物檢測領域的應用說明[S].北京：中國標準出版社，2013.

[6]國家質量監督檢驗檢疫總局.JJF1056.1-2012測量不確定度評定與表示[S].北京：中國標準出版社，2012.

[7]國家質量監督檢驗檢疫總局.SN/T4091-2015食品微生物學測量不確定度評估指南[S].北京：中國標準出版社，2006.

[8]李玉玲，宋莉莉.食品微生物學菌落總數檢驗中不確定度的評定[J].中國衛生檢驗雜志，2005，15（7）：880-896.

[9]楊 燕，李瓊瓊，宋光艷，等.能力驗證乳粉中乳酸菌計數不確定度的評定[J].食品安全質量檢測學報，2016，7（7）：2747-2750.

[10]李 莎，譚 震.酸乳乳酸菌數檢驗中不確定度的評定[J].中國衛生檢驗雜志2012，22（8）：1864-1865.

[11]水 明，張學林.酸牛奶中乳酸菌數的測量不確定度的評定[J].中國牛奶，2007（4）：38-39.

[12]王海華，蘭 茜.能力驗證菌落總數測定結果不確定度的評定[J].食品安全質量檢測學報，2015，6（6）：2354-2355.

[13]國家質量監督檢驗檢疫總局.JJG196-2006常用玻璃量器檢定規程[S].北京：中國計量出版社，2006.