超高效液相色譜快速測定飲料中的食品添加劑

◎ 浦艷靜

（太倉市檢驗檢測中心，江蘇 蘇州 215400）

食品工業快速發展，食品添加劑的種類和使用頻率逐漸增加。現在，全球范圍內能夠使用的食品添加劑種類已達到20 000多種，可見，食品添加劑的使用呈快速增長的趨勢。在現代食品工藝中，飲料的加工制作可以使用防腐劑、甜味劑、合成色素、咖啡因等眾多添加劑。但是，如果這些食品添加劑的使用量超出規定的限值，就會引發一系列食品安全問題，更甚者會危害人們的身體健康。為了保證食品安全，食品添加劑的使用問題引起了人們的廣泛關注。現階段，飲料中食品添加劑的檢測方法有很多種，主要包括光度法、毛細管電泳法等，但是這些方法的使用在靈敏度、分辨率、操作方法等各方面存在些許瑕疵。因此，有人提出了超高效液相色譜檢測方法，與其他檢測方法相比，這種方法有效提升了食品檢測過程中的靈敏度、分析速度、分離度，在食品安全分析和檢測領域得到了廣泛應用，為提升食品質量，保障食品安全起到了十分重要的作用。

1 材料和方法

1.1 樣品和試劑的選擇

本次實驗研究所需要的樣品是來自某超市的銷售企業所送檢的飲料產品，包含碳酸飲料、果汁、茶飲料、含乳飲料共4種。所需試劑包括來自上海安譜公司的乙腈、甲醇、甲酸和乙酸等色譜純級的化學試劑，所用標準物質采用上海安譜公司的標準物質，實驗用水采用從美國MiLLipore公司購進的實驗純水系統制作的一級水。

1.2 標準溶液的制備

按照標準方法配制苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、糖精鈉、乙酰磺胺酸鉀（安賽蜜）、檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅、亮藍和咖啡因的標準溶液，具體是分別準確稱取25 mg標準物質在50 mL的燒杯中，用少量甲醇-水溶解這些標準物質，然后將這些標準物質定量轉移到25 mL的容量瓶中，定容至刻度，避光保存。根據每個不同標準物質的定量限繪制不同濃度的系列標準工作曲線。

1.3 儀器和設備

實驗應用ACQUITY UPLC型號的超高效液相色譜儀，該儀器在應用的時候配有二極管陣列檢測器和Empower 2色譜數據處理系統、XH-C型渦旋混合器、18K型高速離心機。

1.4 樣品前處理

（1）碳酸飲料等含氣飲料先稱取約5～10 g（精確至0.001 g）置于50 mL燒杯中，再進行加熱或超聲除去其二氧化碳，然后轉移至50 mL的容量瓶中，加入適量的水，超聲提取20 min，取出定容到刻度，將樣液轉移離心管中以4 000 r/min離心10 min，取出，取適量上清液過0.22 μm的濾膜，濾液備用，待液相色譜檢測[1]。

（2）乳飲料準確稱取約5 g（精確到0.001 g）試樣于50 mL帶蓋離心管中，加水約25 mL，渦旋混勻，于50 ℃水浴超聲提取20 min，冷卻至室溫后加亞鐵氰化鉀溶液2 mL和乙酸鋅溶液2 mL，混勻，于4 000 r/min離心10 min，將水相轉移至50 mL容量瓶中，于殘渣中加水20 mL，渦旋混勻后超聲5 min，于4 000 r/min離心10 min，將水相轉移到同一50 mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混勻。取適量上清液過0.22 μm濾膜，濾液備用，待液相色譜測定[2]。

（3）果汁飲料準確稱取約5 g（精確至0.001 g）試樣于50 mL帶蓋離心管中，加水約25 mL，旋渦混勻，超聲提取20 min，取出定容到刻度，將樣液轉移離心管中以4 000 r/min離心10 min，取出，取適量上清液過0.22 μm的濾膜，濾液備用，待液相色譜檢測[3]。

（4）茶飲料準確稱取約5 g（精確至0.001 g）試樣于50 mL帶蓋離心管中，加水約25 mL，旋渦混勻，超聲提取20 min，取出定容到刻度，將樣液轉移離心管中以4 000 r/min離心10 min，取出，取適量上清液過0.22 μm的濾膜，濾液備用，待液相色譜檢測[4]。

1.5 色譜條件

色譜柱條件是XBridge Peptide BEH C18色譜柱，流動相是甲醇（A）、20 mmol/L乙酸銨溶液（B），流動速度是0.3 mL/min，柱的溫度是40 ℃，進樣量是20 μL。梯度洗脫程序見表1。質譜基本條件應用電噴霧離子源，具體分為正離子掃描模式和負離子掃描模式；毛細管的電壓是4 000 V，霧化氣的壓力是344.74 kPa，干燥氣體的溫度是360 ℃，干燥氣的流動速度是0.6 mL/min，進樣體積5 μL，傳輸基本電壓是110 V，除液電壓是65 V。數據信息的獲取采用棒狀圖數據采集模式，掃描的范圍在200～500 nm。數據采集和整理之后應用version B.04.00進行定量和定性分析[5]。

表1 梯度洗脫程序表

1.6 實驗測定分析

苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、糖精鈉、乙酰磺胺酸鉀（安賽蜜）、檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅、亮藍和咖啡因食品添加劑保留時間和定量檢測波長分析見表2。結合配制好的標準工作溶液，按照從低到高的濃度順序進行測定，結合多種食品添加劑保留時間和定量檢測波長分析表，對各個組分定量檢測波長提取相應的色譜圖以及各個色譜圖對應的組分峰面積、濃度標準曲線。食品添加劑色譜圖，如圖1所示。

表2 多種食品添加劑保留時間和定量檢測波長表

圖1 食品添加劑色譜圖

2 結果與分析

2.1 色譜分離流動相條件的選擇和優化

①緩沖溶液濃度的確定。乙酸銨以其較好的溶解性和不容易在色譜上殘留的特點，在食品添加劑檢測中經常被人們用來作為緩沖溶液。與一般的液相色譜流動性相比，乙酸銨∶乙腈的流動性較高。在確定實驗色譜條件之后分別選擇10、20、40 mmol/L的乙酸銨溶液進行實驗操作，經過綜合比對分析發現20 mmol/L的乙酸銨溶液能夠更好地滿足分析需求，在節省實驗操作時間的同時還能夠實現基線分離操作。②色譜分離流動相緩沖鹽溶液的酸堿值。色譜分離流動相的酸堿值對分析物的保留時間和峰形有十分重要的影響。在實驗操作中發現，加入乙酸后能夠有效調節酸堿值。在酸堿值的影響下，組分的峰形也會發生相應的變化，保留時間也發生變化。梯度洗脫中乙酸的初始比例較低，出峰較快、拖尾，因而酸堿值不能過高。加上一些添加劑的組分在4 min左右的時候出峰，酸堿值的選擇也不能太低。在綜合比較了酸堿值分別在5.5、5.8、6.0、6.5時對應的分離度和峰形影響，發現酸堿值在5.8～6.0時，各組分離和峰形效果最為理想[6]。

2.2 檢測波長的選擇

各組分經液相色譜分離，二極管陣列檢測器掃描檢測獲得各組分紫外光譜圖，根據各個小組紫外吸收情況，在230 nm的波長位置測試苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、安賽蜜、脫氫乙酸和咖啡因；在410 nm的波長位置測試檸檬黃、日落黃、胭脂紅、誘惑紅、莧菜紅和亮藍；在256 nm波長位置檢測羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯和對羥基苯甲酸丙酯等。

2.3 樣品提取方法的確定

飲料中所應用的食品添加劑大多是水溶性材料，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯和對羥基苯甲酸丙酯等防腐劑具有一定的脂溶性，但大多是以鈉鹽的形式存在。所以，在提取的時候需要在其中加入10%的甲醇溶液，從而達到有效的沉淀作用[7]。

2.4 方法的線性范圍和檢出限

將食品添加劑組分的混合標準溶液按照一定的方法進行分析，參照峰面積Y對標準樣品的質量濃度X進行線性回歸分析，由此得到各個類型化合物的線性回歸方程。線性回歸系數在0.999以上，各個組的線性關系良好，以3倍信噪比計算檢出限。

2.5 方法的回收率實驗

在一個不含有食品添加劑的樣品中添加含量分別是5、10、20 mg/kg的食品添加劑樣品，按照相關規定的方法測定，相應的回收率測定實驗結果見表3。

表3 相應的回收率測定實驗結果表

2.6 精密度實驗

對實驗樣品平行測試5次，具體測試結果見表4。根據對表4的分析發現，RSD的范圍在0.66%～2.20%，這種測量方法具有很好的精密度。

表4 精密度實驗結果分析表

3 結語

本文應用超高效液相色譜測定飲料中常見的苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、糖精鈉、乙酰磺胺酸鉀（安賽蜜）、檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅、亮藍和咖啡因食品添加劑，取得了良好的分離效果，定量檢測準確、測定通量較高。

[1]王 震，石麗珠.超高效液相色譜-串聯質譜測定飲料和酒中防腐劑與甜味劑[J].食品安全質量檢測學報，2014，5（4）：1179-1184.

[2]牟 霄，張 璐，張崇淼，等.超高效液相色譜法同時測定飲料中14種食品添加劑[J].食品安全質量檢測學報，2017，8（8）：3177-3184.

[3]江 生，敖菊梅，潘 正，等.高效液相色譜法同時快速測定飲料中的12種食品添加劑[J].分析試驗室，2017，36（6）：729-731.

[4]劉印平，路 楊，楊立新，等.超高效液相色譜-串聯質譜法快速測定飲料中22種添加劑[J].食品安全質量檢測學報，2015，6（3）：980-986.

[5]陳沛金，張 毅，肖 鋒，等.高效液相色譜法測定糖果、蜜餞和飲料中19種食品添加劑[J].食品安全質量檢測學報，2014，5（11）：3487-3494.

[6]楊 靜.色譜技術在食品中分析檢測及工業化生產中的應用研究[D].濟南：山東大學，2014.

[7]劉騰浩.鍵合鈦膠基質整體固定相的制備及應用研究[D].天津：天津商業大學，2014.