柱前衍生-高效液相色譜法測定甜蜜素的實驗研究

◎ 習 娟

（內蒙古自治區食品藥品審評查驗中心，內蒙古 呼和浩特 010020）

關于甜蜜素的檢測方法，國內標準檢驗方法有氣相色譜法、比色法和薄層層析法[1-2]。但這些方法最低檢測限均高于歐盟和日本的標準，導致這樣一種現象出現，即某些產品在國內未檢測出甜蜜素，而在國外會被檢測出來，這就要求我國的檢測技術必須與國際接軌。筆者查閱大量國內外資料發現，柱前衍生-高效液相色譜法是測定甜蜜素較好的方法[3]，本文通過實驗研究證實其應用價值。

1 材料及方法

1.1 實驗材料

含有甜蜜素的碳酸飲料、果汁飲料、蔬菜汁、乳飲料、植物蛋白飲料，來源于市場。

1.2 試驗方法

本試驗方法是將甜蜜素標準品經過衍生化反應后，用液相色譜檢測甜蜜素。

1.3 標準曲線

1.3.1 標準儲備液的配制

稱取甜蜜素0.100 0 g，用超純水溶解并轉移至100 mL容量瓶中定容，制成濃度為1 mg/mL的標準儲備液待用。

1.3.2 標準溶液的配制

將已配制好的1 mg/mL的標準儲備液，吸取0、1、2、4、5 mL分別移入500 mL容量瓶中以超純水定容，制成標準品濃度為0、2.0、4.0、8.0、10.0 mg/L。

1.3.3 標準曲線的繪制

將已經配制好的標準溶液在已優化好的條件下衍生，以優化好的液相條件進行HPLC的測定，用標準曲線確定峰面積S與溶液濃度c的關系，計算線性回歸方程和相關系數。

1.4 方法精密度的測定

將0.40 mg/mL濃度標樣通過衍生化條件處理，先后進樣6針進行精密度的分析。

1.5 最低檢出限的測定

將0.40 mg/mL濃度的標樣分別稀釋10、100、1 000、10 000倍（濃度分別為0.040、0.004 0、0.000 4、0.000 040 mg/mL）后，測定信號值，采用3倍信噪比計算檢出限。

1.6 回收率和精密度測定

將碳酸飲料和含乳飲料中分別添加4.0 mg/mL濃度的標樣在已優化好的衍生條件和液相條件下進行測定樣品的回收率測定。在已優化好的衍生條件和液相條件下，將碳酸飲料和含乳飲料分別重復測定11次，確定測定樣品的平均值和標準偏差，以此來確定精密度。

1.7 干擾試驗

為排除其他添加劑對方法的影響，在含有甜蜜素的標準溶液中加入安賽蜜、糖精鈉、山梨酸、苯甲酸、亞硫酸鈉后，用同樣的衍生方法以及液相條件檢測，確定此方法的抗干擾性[4]。

1.8 穩定性試驗

將衍生物在室溫、4 ℃條件下，放置4、8、12、24、48 h，在已優化好的液相條件下進行測定，確定衍生物的穩定性。

2 結果與分析

2.1 標準曲線及方法精密度的結果

在已優化好的條件下進行不同濃度標準曲線的繪制，得到的濃度-峰面積曲線如圖1所示。

圖1 標準曲線圖

由圖2可以看出，不同濃度的吸收峰重疊性很好，幾乎完全重合。同時，吸收峰的保留時間均是在合理范圍內，保留時間依次是6.523、6.536、6.516、6.535、6.522 min。此衍生物的線性方程為y=10 195x+9 548.6，相關性為0.999 8，由此可見線性相關很好，甜蜜素的最低檢出限為40 ng/mL。

圖2 不同濃度甜蜜素的譜圖

加入0.4 mg/mL的標準溶液衍生化后進行方法精密度的測定，進樣6針，精密度好，標準偏差小于0.001，見表1。

表1 方法精密度實驗結果表

2.2 干擾實驗結果

在上述已優化好的條件下，通過將標準物質中添加安賽蜜、糖精鈉、山梨酸、苯甲酸、亞硫酸鈉后進行衍生，測定添加物質對標準物質的干擾試驗。結果表明苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、安賽蜜在所選色譜條件下不出峰，而亞硫酸鈉出峰時間在甜蜜素的后面，不干擾測定。

2.3 回收率及精密度結果

在上述已優化好的條件下，向樣品中添加0.4 mg/mL的標準溶液進行衍生化反應，過濾，進行液相回收率的測定，結果見表2，回收率均大于95%，回收率相對較高，所以此曲線適用于飲料的甜蜜素含量測定實驗。

表2 回收率實驗結果表

將碳酸飲料和含乳飲料的樣品進樣11次測定精密度，結果見表3，用高效液相色譜測定飲料中的甜蜜素精密度很高，達到99%以上。

表3 精密度實驗結果表

2.4 樣品中甜蜜素的測定結果

由表4可以看出，碳酸飲料中的甜蜜素含量最高，果汁飲料其次，含乳飲料的含量最少并且未檢出樣品居多；圖3為測定的果汁飲料5#的甜蜜素譜圖。所以，就現代人們對于飲食健康安全的需求而言，可以選擇含乳飲料替代其他飲品。

表4 飲料中甜蜜素的測定結果表

圖3 測定甜蜜素樣品的譜圖

3 結論

（1）本試驗色譜最優化條件為：乙腈與水的比例為75∶25，添加0.02 mol/L乙酸銨緩沖系作為流動相，在波長314 nm處、柱溫33 ℃、流量1.0 mL/ min、進樣量10 μL的條件下，對甜蜜素標準品的衍生物進行測定效果最佳，精密度和回收率較高，且沒有其他同類樣品的干擾。

（2）本試驗對樣品前處理最優化條件為：將樣品溶液用亞鐵氰化鉀-乙酸鉛等比例混合作為沉淀劑，離心取上清液10 mL，加入2mL 1∶1濃硫酸酸化后加5.0 mL濃度為50%的次氯酸鈉溶液衍生5 min，之后用5 mL正己烷、2 g氯化鈉進行萃取，取正己烷層加入10mL 10%碳酸氫鈉溶液，用0.22 μm的過濾膜過濾上樣，進行甜蜜素衍生物的測定。這種前處理方法消除了食品相關成分即食品基質對衍生過程和檢測過程的干擾。

（3）本試驗對市售飲料甜蜜素含量進行測定，測定結果為在飲料類別中含乳飲料的甜蜜素含量最低，未檢出樣品個數最多，但所有樣品均符合國家標準的限值，均屬于安全食品。

（4）本試驗所采用方法比起國家標準所采用方法成本相對較低、操作簡單、檢測效率高且適用于基層實驗室的日常檢測分析，其準確度和精密度也優于國標方法，并且比國家標準方法更適用于蛋白含量高的產品中甜蜜素的測定。

[1]張秀堯.反相高效液相色譜法測定食品中甜蜜素[J].理化檢驗-化學分冊，2000，36（10）：451-452.

[2]劉艷和，馬公強.高效液相色譜法測定食品中甜蜜素[J].中國公共衛生，1998，14（3）：169.

[3]劉鵬春，祁廣建.環境與健康雜志[J].食品衛生理化檢驗，1996（8）：31.

[4]李智紅，尹艷春.反相離子對高效液相色譜法快速分離和定量測定食品中的甜蜜素[J].色譜，1999（3）：278-279.