他莫昔芬對荷瘤裸鼠乳腺癌血管生成和增殖的作用

熊倩 劉秋虹 吳清萍 石玉梅

乳腺癌已成為女性惡性腫瘤發病率的第一位，惡性程度高，侵襲性明顯，復發﹑轉移幾率大。他莫昔芬（TAM）是目前雌激素受體（ER）表達陽性的乳腺癌的一線藥物，其在乳腺組織中能競爭性與雌激素受體結合，從而阻礙ER表達陽性的乳腺腫瘤的生長和繁殖。腫瘤的增殖及新生血管能力在腫瘤的生長﹑轉移﹑過程中發揮著重大的作用，目前用阻斷腫瘤血管來治療腫瘤的方法正逐步探討及應用。本實驗通過乳腺癌MCF-7細胞裸鼠成瘤，TAM治療后腫瘤檢測直徑大小及增殖標記（CyclinD1﹑Ki67）﹑血管標記（VEGF﹑CD34）的變化，探討TAM對乳腺癌的抗細胞增殖及血管形成的作用，期望為實驗室及臨床提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 建立MCF-7乳腺癌細胞荷瘤裸鼠模型。乳腺癌MCF-7細胞由蘇州大學第一附屬醫院核醫學實驗室留存；雌性BALB/c裸鼠，4～5周齡，20只，上海斯萊克實驗動物有限公司。人乳腺癌MCF-7細胞株培養至對數生長期，無菌條件下接種于裸鼠右側腋窩偏前脂肪墊下，繼續飼養于無菌層流罩中。種瘤6～9d后裸鼠右側胸壁皮下可觸及瘤結節，20只均建模成功。自裸鼠接種MCF-7細胞次日起，于右側胸壁瘤旁皮下注0.15mg/ml雌激素0.2ml/（只·d），直至取瘤。

1.2 實驗分組及干預 將建模成功荷瘤裸鼠（細胞接種后第10天）隨機分為觀察組及對照組，每組各10只。觀察組給予 TAM 5mg/（kg·d） 灌胃 1 次，對照組給藥蒸餾水2ml灌胃。

1.3 腫瘤病理學檢測 用藥21d后脫頸處死裸鼠取瘤，記錄腫瘤大小﹑質地情況，腫瘤平均直徑=（最大直徑+最小直徑）/2。腫瘤10%福爾馬林固定24h，常規脫水包埋HE染色。

1.4 免疫組化SP法檢測 結果由三位高年資病理科醫師閱片，并對免疫結果做定量分析。CyclinD1﹑Ki67陽性表達在細胞核，隨機選取 10個高倍視野，每個視野計數 100個腫瘤細胞，計數陽性細胞百分比例。VEGF陽性表達在胞漿/胞膜，采用半定量分析法0%～5%為0分，6%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，＞75%記4分；染色強度：無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；兩個值相乘為最終判讀結果。CD34標記微血管密度（MVD）先在低倍鏡下找血管豐富區域，然后在高倍鏡下計數5個不同區域的血管數，然后求其平均值作為MVD值。以鏡下胞質內有棕黃色顆粒標記為血管內皮細胞陽性。腫瘤內壞死區及與腫瘤交界處軟組織內的微血管不計數，有厚平滑肌壁的血管也排除在外。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤大體檢測及直徑測量 腫瘤多為橢圓，巨檢與周圍組織分界尚清，切面灰白，質地稍硬，測量直徑=（最大直徑+最小直徑）/2。觀察組腫瘤平均直徑（0.9600±0.12649）cm，對照組腫瘤平均直徑（1.0800±0.15492）cm，兩組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。腫瘤直徑曲線圖見圖1。

圖1 腫瘤直徑（cm）曲線圖

2.2 免疫組化結果 見表1和圖2～13。

圖2 ：乳腺癌MCF細胞種植裸鼠成瘤HE染色，細胞彌漫生長，部分區域可見壞死灶。圖3：高倍鏡下腫瘤細胞密集，核仁明顯，偶見核分裂象。圖4：免疫組化CKpan標記，腫瘤細胞強陽性，周邊脂肪細胞陰性，印證腫瘤細胞上皮來源。圖5-6：對照組及觀察組腫瘤免疫組化Ki67標記。圖7-8：對照組及觀察組腫瘤免疫組化CyclinD1標記。圖9-10：對照組及觀察組腫瘤免疫組化VEGF染色，腫瘤胞漿深淺不等褐染。圖11-13：腫瘤血管內皮CD34標記，其中11為對照組腫瘤內血管以小血管為主，管腔不規則，內皮細胞部分核較大；圖12為觀察組CD34染色；圖13為腫瘤周邊與脂肪組織交界處，可見脂肪中形態溫和血管

表1 觀察組和對照組免疫指標評分比較（）

表1 觀察組和對照組免疫指標評分比較（）

組別 觀察組（n=10） 對照組（n=10） t值 P值CyclinD1（%） 19.8000±3.76534 15.6000±1.77639 2.957 0.016 Ki67（%） 35.6000±5.6112 29.9000±4.30633 2.703 0.024 VEGF 8.7000±01.63639 7.4000±1.26491 2.899 0.018 CD34 87.0000±10.42433 79.4000±6.44981 2.403 0.040

3 討論

本研究MCF-7乳腺癌荷瘤裸鼠經TAM灌胃治療21d后，觀察組和對照組直徑大小變化差異無統計學意義（P＞0.05）。但細胞增殖指標及血管計數有變化，可能有以下原因：（1）每只小白鼠對腫瘤細胞的耐受程度不完全相同，處死前期大部分老鼠已經出現極度消瘦﹑惡病質現象，但有2只荷瘤裸鼠狀態基本正常。（2）每只荷瘤裸鼠對他莫昔芬的敏感性有輕微差異。（3）他莫昔芬臨床應用長期效果較好，本實驗可能時間較短。動物實驗將用藥外其它因素盡量保持一致，但實驗分組對照試驗與臨床用藥前后腫瘤大小的比較尚有一定的區別。

乳腺癌MCF-7裸鼠腫瘤組織常規病理HE染色顯示，腫瘤細胞彌漫生長，間質較少，細胞多邊形，部分區域可見壞死灶，高倍鏡下可見腫瘤細胞核仁明顯，偶見核分裂象。腫瘤巨檢邊界尚清，但鏡下可明確腫瘤無包膜，免疫組化作CKpan標記顯示：腫瘤浸潤至周圍脂肪組織中，交界處褐色為腫瘤細胞，白色為脂肪組織，同時顯示了腫瘤細胞上皮來源特性。

細胞周期的啟動G1期的是關鍵，而CyclinD1是調控G1期的細胞周期素依賴激酶的調節因子。盧夢玲等［1］陳述CyclinD1的主要功能是促進細胞增殖，其過度表達可致細胞失控而惡性變。也有學者［2］證明阿司匹林聯合他莫昔芬可下調乳腺癌細胞周期蛋白D1并阻斷G0 / G1期細胞周期。Ki-67最早在1983年由Gerdes等［3］在檢測一種淋巴瘤細胞核抗原時發現的，其表達增強是細胞增生活躍的一個反映。余海等［4］報道乳腺癌新輔助化療后Ki67可有明顯降低。本資料研究荷瘤裸鼠乳腺癌經TAM灌胃治療21d后與對照組比較增殖指標CyclinD1﹑Ki67的變化，二者的陽性表達均在細胞核，棕色至褐色不等，與對照組比較，TAM灌胃組增殖指標的表達評分均下降且差異有統計學意義（P＜0.05），證明他莫昔芬對乳腺癌腫瘤細胞有抑制增殖的作用。

血管不但可以為腫瘤細胞提供需要的營養物質，運走代謝產物，近年來對腫瘤血管的研究逐漸增多。VEGF 是乳腺癌血管新生過程中最重要的促血管生成因子之一，在多種腫瘤組織中均表達，而且VEGF表達的濃度可以作為腫瘤預后的先兆指標。有研究［5］表明他莫昔芬可抑制SK-BR-3 乳腺癌細胞株裸鼠血清中VEGF的分泌，降低腫瘤組織中VFGF的表達。還有研究［6］顯示在肝細胞癌的診治過程中，可以動態監測血VEGF水平及蛋白表達水平，動態評估腫瘤的療效及進展。CD34分子是高度糖基化的跨膜糖蛋白，可以在血管內皮中表達。有學者［7］指出CD34被稱為微血管密度研究的最佳標記物。本資料觀察組VEGF陽性表達在胞漿/膜，免疫組化結果表現為深淺不等的彌漫或成片的棕褐色，CD34表達在血管內皮細胞呈陽性，結果顯示，觀察組與對照組比較表達水平均下調且差異有統計學意義（P＜0.05），表明他莫昔芬對腫瘤的血管生成有抑制作用。從血管指標CD34的免疫組化結果分析，腫瘤組織中的微血管密度大，尤其是腫塊周邊地區，中心部分可見小灶狀缺血壞死。腫瘤血管形態極不規則，多為分支狀，內皮細胞增生活躍，腫瘤表面的脂肪組織中血管密度明顯降低，且多為薄壁略擴張的小血管，形態較溫和。VEGF腫瘤細胞幾乎全部為陽性表達，所以免疫組化評分主要依賴色差。由于免疫組化染色的深淺容易受多種因素的干擾，故采用免疫組化方法判定腫瘤血管的變化VEGF并非最理想指標。

綜上所述，CyclinD1﹑Ki67通過促進腫瘤細胞的增殖而促進癌的生長發展，VEGF﹑CD34通過血管內皮細胞的增殖，提高內皮細胞通透性來促進“養料”的運輸﹑腫瘤的轉移。TAM作為乳腺癌內分泌藥物，除了與腫瘤細胞競爭雌激素受體，使腫瘤細胞“養分”減少而直接抑制腫瘤細胞外，還可以抑制微血管的生成，減少腫瘤“養分”的運輸，期望對未來腫瘤實驗室及臨床診治提供新的診療途徑。

［1］ 盧夢玲,閆超,賴多,等．Cyclin D1與細胞周期調控．生物技術通報,2011,11(10):55-59．

［2］ Cheng R,Liu YJ,Cui JW,et al．Aspirin regulation of c-myc and cyclinD1 proteins to overcome tamoxifen resistance in estrogen receptor-positive breast cancer cells．Oncotarget,2017,8(18):30252．

［3］ Gerdes J,Schwab U,Lemke H,et al．Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation．Int J Cancer,1983,31(1):1．

［4］ 余海云,李文萍,郜紅藝,等．新輔助化療療效與乳腺癌Ki67、P53表達的關系．中華乳腺病雜志(電子版),2011,5(3):297-305．

［5］ 趙明智．他莫昔芬對SK-BR-3乳腺癌細胞株荷瘤裸鼠血管生成的作用及機制研究．河北大學,2015．

［6］ Liu K,Min XL,Peng J,et al．The Changes of HIF-1 and VEGF expression after tace in patients with hepatocellular carcinoma．Journal of Clinical Medicine Research, 2016, 8(4): 297-302．

［7］ Xiangyi Kong, Jian Guan, Wenbin Ma, et al． CD34 Over-Expression is Associated With Gliomas' Higher WHO Grade．Medicine, 2016,95(7):e2830．