肝細胞肝癌患者癌組織中Ras相關C3肉毒素底物1、轉化生長因子β1表達變化及其意義

黃國林，滕翠芳，羅燕妹，覃貴慧，駱敏，陽潔

(廣西醫科大學藥學院，南寧530021)

我國是全球肝癌發病率最高的國家之一，我國的肝癌發病人數約占全球的55%。70%～90%的原發性肝癌為肝細胞肝癌(HCC)。手術切除是HCC首選治療方法，術后高轉移率和高復發率是導致HCC患者死亡的主要原因[1]。目前HCC轉移和復發的機制尚未完全明確。Ras相關的C3肉毒素底物1(Rac1)是Rho樣小GTP酶家族中的一員，在調控腫瘤細胞的生長、侵襲、轉移等方面具有重要作用[2]。最新研究[3, 4]發現，Rac1與HCC的侵襲、轉移及不良預后密切相關。轉化生長因子β1(TGF-β1)在乳腺癌、大腸癌等多種腫瘤的發生發展過程中具有雙重作用，既可作為腫瘤促進因子也可作為腫瘤抑制因子[5]。目前Rac1與TGF-β1在HCC發生、發展中的作用機制仍不明確。我們觀察了HCC組織中Rac1、TGF-β1的表達變化，并分析其與臨床病理特征及預后的關系。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年11月～ 2013年4月間廣西醫科大學第一附屬醫院收治的HCC患者73例，其中男64例、女9例；年齡14 ～ 73歲，中位年齡46歲；據TNM分類標準分為Ⅰ級30例、Ⅱ級15例、Ⅲ級28例；25例存在HCC轉移。均行HCC切除術，術中保留HCC組織及相應的癌旁組織(距離癌灶>2 cm處的肝組織)，術后病理顯示73例份癌旁組織中18例為肝硬化、55例為正常肝組織，全部標本經4%多聚甲醛固定、脫水、常規石蠟包埋后作4 mm連續切片。

1.2 試劑 兔抗人Rac1多克隆抗體購自美國Signalway Antibody(SAB)公司；鼠抗人TGF-β1單克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司；HRP鼠兔通用型二抗購自上海長島生物技術有限公司；DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 HCC癌組織及癌旁正常組織Rac1、TGF-β1檢測 采用免疫組化法檢測HCC癌組織、癌旁正常組織Rac1、TGF-β1。抗Rac1多克隆抗體及抗TGF-β1單克隆抗體均按1：100稀釋。陽性對照為已知陽性切片，陰性對照以PBS代替一抗。切片常規脫蠟至水，以檸檬酸液(pH 6.0)作為修復液，用高壓鍋熱壓修復抗原3 min， 過氧化氫(質量分數為3%)處理10 min消除內源性過氧化物酶，PBS沖洗后加一抗于37 ℃孵育1.5 h，PBS沖洗后加二抗于37 ℃孵育30 min，加DAB工作液顯色后用蘇木素染色1 min、鹽酸酒精脫水透明、晾干封片后在光鏡下觀察。每張切片在光鏡下取10個具有代表性的視野，每張切片均由兩位病理醫師獨立觀察。判斷標準：Rac1和TGF-β1陽性染色均為在細胞質中有黃色顆粒沉著。根據細胞質的染色程度以及染色細胞的百分率來進行評分[6, 7]：基本不著色者計0分，淡黃色者計1分，黃色計2分，棕黃色或棕褐色計3分；Rac1染色細胞百分率<5%計0分，5%～25%計1分，25%～50%計2分，50%～75%計3分，>75%計4分；TGF-β1染色細胞百分率0%計0分，<10%計1分，10%～50%計2分，>50%計3分。將每張切片染色程度得分與染色細胞率得分相乘即為最終分數，分數≤3視為低表達，>3視為高表達。計算Rac1、TGF-β1的陽性表達率(陽性表達例數/總例數)。

1.4 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件進行分析。應用GraphPad Prism 6軟件進行作圖，所得半定量資料用χ2檢驗，兩兩之間相關分析用Spearman 相關性分析檢驗，用Kaplan-Meier生存曲線分析Rac1和TGF-β1共同高表達與HCC預后的相關性并用log-rank法進行檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

HCC組織、癌旁正常組織Rac1的陽性表達率分別為37.0%(27/73)、20.5%(15/73),二者比較，P<0.05；HCC組織、癌旁正常組織TGF-β1的陽性表達率分別為61.6%(45/73)、28.8%(21/73)，二者比較，P<0.05。

Rac1、TGF-β1表達與HCC臨床病理參數的關系見表1。Rac1或TGF-β1的表達與HCC患者年齡、性別、Edmondson-Steiner分級、肝硬化、腫瘤囊狀浸潤、腫瘤結節、血管侵襲及乙肝表面抗原等臨床病理特征均無關(P>0.05)。HCC組織TGF-β1的表達與腫瘤直徑、血清甲胎蛋白表達、門靜脈癌栓、TNM分期、淋巴結轉移有關(P均<0.05)Rac1與TGF-β1在HCC中的表達呈正相關(r=0.313，P<0.01)，與單獨高表達Rac1或TGF-β1相比，Rac1與TGF-β1的共同高表達與HCC 的TNM分期及轉移有關(χ2=12.244，P<0.01；χ2=8.318，P<0.01)。

表1 Rac1和TGF-β1表達與 HCC患者臨床病理參數的關系(例)

本研究對35例HCC患者進行隨訪。kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示，單獨高表達Rac1或TGF-β1的患者與單獨低表達Rac1或TGF-β1的患者的中位生存期無統計學差異(P均>0.05)；共同高表達Rac1與TGF-β1的患者較共同低表達Rac1與TGF-β1的患者中位生存期短(χ2=6.225，P<0.05)，另外， Rac1與TGF-β1共同高表達的患者和單獨高表達Rac1或TGF-β1的患者的中位生存期無統計學差異(P均>0.05)。

3 討論

Rho樣小GTP酶家族中的Rac1與HCC的發展密切相關。負性調節Rac1活性及其表達，可誘導HCC細胞凋亡，顯著抑制HCC生長與轉移[8]，并且HCC細胞核中過表達的Rac1與HCC患者的不良預后相關[3]。反之，異常高表達Rac1能夠促進HCC細胞的侵襲和遷移[9]。本研究發現，Rac1主要表達于HCC組織的細胞漿，且其表達顯著高于癌旁組織，提示胞質中高表達的Rac1可能與HCC的發生發展密切相關。同時，我們將Rac1表達與患者臨床病理資料進行統計分析后發現，Rac1在晚期、有轉移的HCC組織中的表達明顯高于早期、無轉移的HCC組織。這些結果表明，HCC胞質中高表達的Rac1與HCC TNM分期以及轉移呈正相關。

TGF-β1是TGF-β家族中分布最廣泛且含量最豐富的亞型，研究[10]發現，TGF-β1在HCC的發生發展過程中具有促瘤和抑瘤的雙重作用，在腫瘤早期TGF-β1可作為一個腫瘤抑制因子，起到抑制腫瘤進展的效果，而在腫瘤晚期，TGF-β1則具有促進腫瘤進展的作用。另外有研究[11]發現，TGF-β1在HCC組織的表達明顯高于正常肝組織，聯合TGF-β1和ELF檢測可有效地進行HCC的預后評估。此外，有研究[12]表明，TGF-β1促進HCC進展的機制為促進腫瘤EMT，從而促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。

TGF-β1與Rac1兩者表達呈正相關；與單獨高表達Rac1或TGF-β1相比，Rac1與TGF-β1共同高表達與HCC 的TNM分期及轉移呈正相關。Rac1與TGF-β1共同高表達的患者比共同低表達的患者其復發時間更短。這些結果表明，HCC胞質中共同高表達的Rac1和TGF-β1與HCC的惡性進展及不良預后呈正相關。但目前，Rac1與TGF-β1在HCC中共同高表達的機制尚不清楚。Rac1可間接上調腫瘤細胞的TGF-β1表達。Rac1激活Smad2信號通路從而上調TGF-β1介導的促腫瘤細胞轉移作用，促進胰腺導管癌細胞的生長和轉移[13]。另一方面，TGF-β1也可間接誘導或激活腫瘤細胞的Rac1表達。Binker 等[14]發現，在人胰腺癌細胞中，TGF-β1可直接激活Rac1/ROS/NF-κB信號通路從而誘導Rac1的表達。Hubchak 等[15]研究發現，在人腎系膜細胞中，Rac1可以通過PI3K/Akt信號通路激活TGF-β1，并且用TGF-β1處理人腎系膜細胞5 min后可直接激活Rac1。外加TGF-β1刺激人肝星狀細胞LX-2可以促進Rac1的表達，同時外加SMA則可以抑制這一作用[16]。提示Rac1與TGF-β1之間存在互相調控的關系。據此我們推測，Rac1與TGF-β1可能通過Smad2[13]、ROS/NF-κB[14]、PI3K/Akt[15]等一些信號通路而互相激活，從而共同參與HCC惡性進展。但兩者之間具體的分子調控機制及與HCC進展之間的關系，還需進一步深入研究。

綜上所述，HCC組織中Rac1、TGF-β1均呈高表達。Rac1、TGF-β1共同高表達與HCC的進展及不良預后有關。。

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